结直肠癌KRAS、NRAS和BRAF 基因突变与病理特征、吸烟和饮酒之间的相关性*

吴新新，马　杰，任鹏飞，郭晓萱，郭永军

郑州大学附属肿瘤医院分子病理科 郑州 450003



结直肠癌KRAS、NRAS和BRAF 基因突变与病理特征、吸烟和饮酒之间的相关性*

吴新新，马杰，任鹏飞，郭晓萱，郭永军#

郑州大学附属肿瘤医院分子病理科 郑州 450003

关键词结直肠癌；基因突变；病理特征；KRAS；NRAS；BRAF；吸烟；饮酒

摘要目的：探讨 KRAS、NRAS和BRAF基因在结直肠癌中的突变率，分析3种基因突变与结直肠癌病理特征、吸烟和饮酒之间的关系。方法：用石蜡组织DNA提取试剂盒提取DNA，应用实时荧光定量PCR技术检测结直肠癌组织中KRAS 2号外显子的12密码子和13密码子常见的7个突变位点，检测NRAS 2号与3号外显子的12密码子、13密码子与61密码子常见的12个突变位点，检测BRAF 15号外显子的V600E位点的突变，分析KRAS、NRAS和 BRAF 基因在结直肠癌中的突变率与病理特征、吸烟和饮酒之间的相关性。结果：KRAS、NRAS和BRAF基因的突变率分别为38.0%(93/242)、5.0%(12/237)和2.1%(5/237)。在147例KRAS 野生型病例中NRAS与BRAF的突变频率为6.8%(10/147)和3.4%(5/147)。BRAF与KRAS、NRAS基因突变相互排斥。KRAS基因突变更倾向发生于Duke′S分期的C期(P=0.047)和淋巴结转移的患者(P=0.049)，与年龄、性别、肿瘤部位、组织学类型、分化程度、远处转移、癌结节及AJCC分期等病理特征无关(P均>0.05)。NRAS和BRAF基因突变与病理特征无关(P均>0.05)。KRAS、NRAS和BRAF 基因突变与吸烟及饮酒史无关(P>0.05)。结论：该研究中KRAS基因突变更倾向发生淋巴结转移和Duke′S C期，说明KRAS基因突变对转移性结直肠癌有更重要的临床意义。

AbstractAim: To discuss KRAS, NRAS and BRAF gene mutation rates in colorectal cancer and to analyze the relationship between KRAS, NRAS and BRAF gene mutation and the pathological features smoking and drinking of patients with colorectal cancer.Methods: DNA was extracted with paraffin tissue DNA extraction kit, real-time fluorescent quantitative PCR technology was used to detect 7 mutations in codons 12, 13 of exon 2 of KRAS,12 mutations in codons 12, 13 and 61 of exon 2, 3 of NRAS, and BRAF mutation in V600E of exon 15 in colorectal cancer tissue, and to analyze the relationship between KRAS, NRAS and BRAF gene mutation and pathological features, smoking, and drinking in patients with colorectal cancer.Results: KRAS, NRAS and BRAF gene mutation rate was 38.0%(93/242), 5.0%(12/237), 2.1%(5/237), respectively. Among 147 patients with wild-type KRAS, the mutation rate of NRAS was 6.8%(10/147), and BRAF was 3.4% (5/147). BRAF, KRAS and NRAS mutation was mutually exclusive. KRAS mutation was more likely occurred in the Duke′S stage C patients(P=0.047) and lymph node metastasis patients(P=0.049),and there was no significant relation between KRAS mutation and age, gender, tumor location, histological type, differentiation degree, distant metastasis, nodules, or AJCC staging(P>0.05). And there was no significant relation between NRAS and BRAF gene mutation and pathological features(P>0.05). KRAS, NRAS and BRAF gene mutation was not obviously associated with a history of smoking or drinking(P>0.05).Conclusion: In this study,the KRAS gene more likely occurs in patients with lymph node metastasis and Duke′S C period, indicating that KRAS gene mutation has more important clinical significance for metastatic colorectal cancer.

*河南省科技创新型人才工程资助项目

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的消化道肿瘤之一，近年来应用基因检测的方法判断CRC预后及指导基因靶向治疗已成为重要手段。其中RAS基因是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)信号通路中的关键性靶点，在CRC演变过程中发挥了重要作用[1]。抗EGRE抗体(西妥昔单抗和帕尼单抗)主要与内源性配体竞争性结合EGFR，阻断下游的RAS信号通路产生抗肿瘤效应。研究[2]显示只有携带KRAS野生型的CRC患者才能从抗EGRE治疗中获益。因此KRAS基因突变状态成为预示CRC患者能否从抗EGRE治疗中获益的有效指标,但是仍然有一部分KRAS野生型基因携带者无法从抗EGFR治疗中获益，这表明在EGFR下游的RAS-RAF-MAPK和 PI3-KAKT-mTOR信号传导通路中存在的其他突变基因(例如NRAS、BRAF、PIK3CA和PTEN基因突变)可能导致CRC患者无法从抗EGRE治疗中获益，因此，研究CRC中KRAS/NRAS/BRAF基因突变情况，将对临床治疗具有重要意义[3]。该研究应用实时荧光定量PCR方法检测KRAS、NRAS和 BRAF基因在CRC中的突变率，并分析其与CRC病理特征、患者吸烟和饮酒情况的相关性，明确中国人群KRAS、NRAS和 BRAF基因的突变特征，指导临床CRC的个体化治疗，为选择合适的临床治疗方案提供依据。

1材料与方法

1.1临床标本和资料收集郑州大学附属肿瘤医院分子病理科2014年3月至6月确诊为CRC的242患者的甲醛固定的石蜡包埋组织。其中242例检测KRAS基因第2号外显子的12密码子和13密码子7个突变位点，237例检测NRAS基因 2号外显子和3号外显子的12、13和61密码子12个突变位点，237例检测BRAF 基因15号外显子V600E位点突变。查阅临床病例资料，收集患者的性别、年龄、病理诊断、吸烟和饮酒史。在收集病理特征时，部分病例数据缺失，在做相应基因突变与病理特征相关性分析时，去除缺失病例，只保留有效数据。

1.2标本处理及检测方法每例标本取3～5 μm厚的10卷石蜡组织，用二甲苯脱蜡，乙醇洗脱二甲苯后金属浴100 ℃烘干。采用TIANGEN 石蜡包埋组织DNA提取试剂盒提取DNA。用NANO DROP 2000测定所提取的DNA浓度，调整最适质量浓度为20 μg/ L，OD(450)值1.8～2.0。采用实时荧光定量PCR方法检测基因突变， KRAS、NRAS和 BRAF 基因突变检测试剂盒购于北京雅康博公司。

1.3统计学处理采用SPSS 20.0进行分析，应用χ2检验或Fisher精确概率法比较KRAS、NRAS和BRAF 基因突变率在不同年龄段、性别、肿瘤部位、组织学类型、分化程度、远处转移、淋巴结转移、癌结节、AJCC分期和Duke′S分期等病理特征和吸烟、饮酒是否存在统计学差异，检验水准取α=0.05。

2结果

2.1CRC患者KRAS 、NRAS和BRAF基因突变与病理特征之间的关系见表1。242例CRC标本做了KRAS基因突变检测检测，其中突变型93例，野生型149 例，突变率为38.0%。237例CRC标本做了NRAS 基因突变检测，其中突变型12例，野生型225例，突变率为5.0%。237例CRC标本做了BRAF 基因突变检测检，其中突变型5例，野生型232例，突变率为2.1%。

表1　CRC患者KRAS、NRAS和BRAF基因突变与病理特征之间的关系

*：Fisher精确概率法。

2.2KRAS基因野生型中NRAS与BRAF基因的突变率在149例KRAS基因野生型病例中共147例分别做了NRAS与BRAF基因突变检测，其中10例NRAS基因突变，突变率为6.8%，5例BRAF基因突变，突变率为3.4%，在KRAS基因野生型病例中NRAS与BRAF基因突变率与病理特征之间没有相关性(P>0.05)。

2.3CRC患者KRAS、NRAS 和BRAF基因突变与吸烟和饮酒的关系见表2。

表2　CRC患者KRAS、NRAS和BRAF基因突变与吸烟、饮酒之间的关系

*：Fisher精确概率法。

3讨论

在CRC中常见的突变位点位于2号外显子的12密码子与13密码子，突变率为30%～40%。该研究共检测了242例患者，KRAS基因突变率为38%，突变更倾向于发生Duke′S分期的C期和淋巴结有转移的患者，与其他病理特征之间没有明显的相关性。高静等[4]报道966例中国CRC患者KRAS基因突变率为38.8%，与该研究结果一致，并且认为KRAS基因在女性肿瘤分化程度好的右边结肠的突变率高，且与患者的年龄也有关。另外有研究[5]报道，KRAS基因突变率为40.4%，突变更易发生于女性患者，与其他病理特征无相关性。

有研究[6-7]已经证明携带有KRAS基因突变的CRC患者对抗EGFR治疗无效，然而并不是所有携带KRAS基因野生型患者都能够从抗EGFR治疗中受益，仍有40%～60%的KRAS基因野生型患者对抗EGFR治疗无效[8]，在EGFR下游的RAS-RAF-MAPK和 PI3K-AKT-mTOR的信号通路中存在NRAS、BRAF、PIK3CA和PTEN等一些其他突变基因。NRAS基因与KRAS基因一样同属于RAS家族，在国外的研究[9]报道中NRAS基因在CRC中的突变率为2.7%，突变频率在远端结直肠癌较高。而在Irahara等[10]的报道中NRAS的突变率2.2%，突变较易发生在女性患者的左半结直肠。该研究结果显示NRAS的突变率为5%，高于国外突变率；在KRAS野生型基因中NRAS突变率为6.8%，说明即使CRC患者检测KRAS基因为野生型，仍有6.8%的概率由于NRAS的突变而表现出对靶向治疗无效。BRAF基因在多种癌组织存在突变，最常发生于黑色素瘤、甲状腺癌和CRC，BRAF基因在CRC中的突变往往与不良的预后有关[11]。高静等[4]报道966例BRAF基因突变中，BRAF突变率为4.4%，在分化程度差和右半结肠中突变率高，与其他病理特征没有相关性。Kadowaki等[12]报道811例肿瘤患者中BRAF基因的突变率为5%，在近端结直肠、黏液癌和分化差的组织中突变率高。该研究结果显示BRAF基因突变率为2.1%，在KRAS野生型基因中的突变率为3.4%，与病理特征没有相关性，并且BRAF基因与 KRAS和NRAS基因突变相互排斥。BRAF基因突变率均低于国内外报道，可能与该研究的样本量小有一定的关系。

国内外关于KRAS、NRAS和 BRAF基因在CRC中突变状态与病理特征之间关系的研究结果各有差异，这可能与检测方法、样本量和地区差异有关[4-5,7,13]。目前在国内关于NRAS基因在结直肠癌中的突变率的研究缺乏大样本量的研究，该研究中NRAS基因突变率为5.0%，明显高于国外，因此在行抗EGFR治疗前，有必要把 NRAS基因列入常规基因检测。虽然现在仍无证据表明可以根据BRAF的突变状态使用抗EGFR治疗，但有研究[4,12]显示BRAF突变伴有一些高危的临床病理特征，与近端CRC、分化差、T4期肿瘤有关，在 2015年的NCCN临床实践指南中推荐诊断为Ⅳ期的CRC患者行BRAF的突变检测。

该研究同时分析了CRC患者KRAS、NRAS和 BRAF基因突变与吸烟和饮酒之间的关系，未发现它们之间存在关联性，提示CRC患者KRAS 、NRAS 和BRAF基因的突变率可能不受吸烟与饮酒因素的影响，但该结论是否受样本量与质量的限制，仍需有待进一步去验证。

参考文献

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[13]赵恒飞.KRAS基因第12、13位密码子突变型大肠癌患者的临床病理特征、靶向治疗疗效及生存分析[D].长春:吉林大学,2014.

(2015-05-15收稿责任编辑赵秋民)

Relationship between KRAS,NRAS and BRAF gene mutation and pathological features,smoking and drinking of patients with colorectal cancer

WUXinxin,MAJie,RENPengfei,GUOXiaoxuan,GUOYongjun

DepartmentofMolecularPathology，theAffiliatedTumorHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450003

Key wordscolorectal cancer;gene mutation;pathological characteristic;KRAS;NRAS;BRAF;smoking;drinking

中图分类号R734.34

通信作者#，男，1963年6月生，博士，研究员，研究方向：分子病理，E-mail:yongjunguo@hotmail.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.010