分子印迹固相萃取/高效液相色谱法测定猪肝中盐酸克伦特罗的方法研究

汤凯洁，罗秋水*，余瑞龙，吴秋浩

(1.江西农业大学　食品科学与工程学院，江西　南昌　330045；2.南昌市农产品质量安全与

控制重点实验室，江西　南昌　330045)



分子印迹固相萃取/高效液相色谱法测定猪肝中盐酸克伦特罗的方法研究

汤凯洁1,2，罗秋水1,2*，余瑞龙1,2，吴秋浩1,2

(1.江西农业大学食品科学与工程学院，江西南昌330045；2.南昌市农产品质量安全与

控制重点实验室，江西南昌330045)

摘要：建立了分子印迹固相萃取/高效液相色谱法测定猪肝中盐酸克伦特罗残留量的方法。以ASB C18色谱柱( 250 mm ×4.60 mm，5 μm )分离，流动相为甲醇-水(45∶55，pH 3.0)，紫外检测波长243 nm，进样量10 μL，流速0.6 mL/min,柱温30 ℃。分子印迹固相萃取条件为：上样溶剂为双蒸水，上样流速为0.6 mL/min；洗脱剂为1%三氟乙酸的甲醇溶液。上述优化条件下,该方法在0.432~4.32 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数(r)为0.999 0。加标回收率为84.7%~92.0%，相对标准偏差(RSD)为1.5%~1.8%。方法的准确度和精密度满足残留分析的要求。

关键词：分子印迹固相萃取；高效液相色谱法；猪肝；盐酸克伦特罗

盐酸克伦特罗(Clenbuterol hydrochloride，CLB)，俗名“瘦肉精”，化学名为“2-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇盐酸盐”，药品名为“克喘素”，是一种β2-肾上腺素激动剂[1-2]。CLB在动物体内能增强脂解和减慢蛋白质分解代谢，具有调节营养物质的流向和重新分配的作用。人食用有CLB残留的动物组织后，会对肝、肾等内脏器官产生毒害，出现心悸、头痛、目眩、恶心、呕吐、心率加快、肌肉震颤等症状，严重者甚至抽搐、晕厥,对患有高血压、心脏病、甲亢、前列腺肥大的患者危害更大[3-4]。1997 年我国农业部正式禁止将“瘦肉精”作为添加剂应用在饲料中，但受利益的驱使，近年来仍存在违法滥用该药的现象，由此造成的消费者中毒事件屡有报道，严重危害了广大人民群众的身体健康，因而加强“瘦肉精”残留的监测工作仍然十分必要。

王培龙等[5]报道了动物尿液中盐酸克伦特罗的分子印迹固相萃取/气相色谱-质谱研究方法，分子印迹固相萃取能较好地净化动物尿液样品，在盐酸克伦特罗出峰位置无任何干扰峰。猪肉中克伦特罗残留的高效液相色谱分析方法已有多篇文献报道[6-8]，而猪肝作为重要的解毒器官之一，其可能的残留量更高，应引起消费者和相关执法部门重视。采用分子印迹固相萃取柱预处理猪肝样品，并进行盐酸克伦特罗检测的方法研究国内外鲜见文献报道。

国标GB/T 5009.192-2003中的盐酸克伦特罗残留检测有3种方法[9]，分别为酶联免疫法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱-质谱联用法(GC-MS)。ELISA法方便快速，但由于干扰物质多，易产生假阳性，且不能准确定性和定量，阳性样品需进一步采用仪器方法确证。HPLC法和GC-MS法虽然定性定量准确，但国标样品预处理步骤多、过程繁琐，需要反复萃取和净化，不仅耗时长，而且由于步骤多导致回收率偏低。分子印迹聚合物的应用已有多篇文献报道[10-12]，基于具有特异识别性能的分子印迹固相萃取小柱进行预处理，可减少样品预处理步骤，提高回收率。本实验优化了分子印迹固相萃取条件、流动相组成和pH值，建立了分子印迹固相萃取/高效液相色谱检测猪肝样品中盐酸克伦特罗的方法，相比国标方法，该方法的样品预处理操作更简单、快速，回收率高，重现性好，结果准确可靠，可满足分析要求。

1实验部分

1.1材料与仪器

猪肝：购自江西农业大学菜市场。盐酸克伦特罗标准样品：上海药物研究所；甲醇、甲酸、三氟乙酸、醋酸铵均为国产色谱纯试剂。

分子印迹固相萃取柱(Supelco MIP-clenbuterol，Sigma-Aldrich 公司)；高效液相色谱仪(美国Waters 公司);KQ3200型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；WD-12水浴氮吹仪(杭州奥盛仪器有限公司)；BS224S型电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；JK-12固相萃取装置(北京京科瑞达科技有限公司)；TDL-5台式离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2实验方法

1.2.1标准样品的配制准确称取盐酸克伦特罗标准品0.043 2 g，以甲醇溶解，定容至100 mL，摇匀，配制成质量浓度为0.432 mg/mL的标准储备液，置于4 ℃冰箱中避光存放。临用前再用甲醇稀释成适当浓度的标准工作液。

1.2.2样品预处理准确称取捣碎的新鲜猪肝10 g于离心管中，加20 mL甲醇-双蒸水(50∶50)，超声处理30 min，取出上清液，残渣中再加10 mL甲醇-双蒸水(50∶50)，超声提取30 min，合并两次上清液。将上清液于4 000 r/min离心30 min，倾出上清液至浓缩瓶中，在旋转蒸发仪上60 ℃浓缩至干。

1.2.3HPLC色谱条件色谱柱：ASB C18柱( 250 mm ×4.60 mm，5 μm )；流动相：甲醇-水(45∶55，pH 3.0)，使用前经0.45 μm滤膜抽滤装置脱气。紫外检测波长：243 nm；进样量：10 μL；流速：0.6 mL/min;柱温：30 ℃。

2结果与讨论

2.1流动相的优化

流动相的组成直接影响待测物的峰形和出峰时间，目前检测盐酸克伦特罗的流动相有甲醇-水[13]、甲醇-0.02%乙酸铵[14]、甲醇-0.02%磷酸二氢钠[15]、乙腈-20 mmol/L磷酸二氢钾[16]等。本实验参照了国标GB/T 5009.192-2003中高效液相色谱测定动物性食品中盐酸克伦特罗残留量的流动相配比，但盐酸克伦特罗的色谱峰与溶剂峰无法达到完全分离(见图1a)，因此在国标流动相的基础上对流动相配比和pH值做了进一步的考察。当在甲醇-水(45∶55)流动相中添加甲酸调节pH值时，发现不同的pH值对样品和溶剂峰的分离有很大影响(图2)，当pH 3.0时，样品峰和溶剂峰得到了良好的分离(见图1b)。

进一步研究了流动相pH值对盐酸克伦特罗峰形和出峰时间的影响，结果见图2。当流动相pH值为3.0时，样品峰与溶剂峰的分离度及峰形良好。而当流动相pH值为3.4时，样品在非极性色谱柱上的保留增强，出峰时间略晚，且不能与溶剂峰完全分开。当流动相pH值为2.8时，色谱图分离不理想。因此本实验中流动相均采用甲醇-水(45∶55)，以甲酸调至pH 3.0。

2.2分子印迹固相萃取条件的优化

Supelco MIP-clenbuterol分子印迹固相萃取(MISPE)柱填料是以盐酸克伦特罗为模板合成的高分子印迹材料，该柱可选择性吸附复杂样品中的盐酸克伦特罗，而对杂质为非选择性吸附，易淋洗。因此，采用该样品预处理方法可简化国标方法中的多步液液反复萃取、净化步骤，提高萃取回收率。MISPE方法中上样溶剂、上样速度和洗脱溶剂对待测物回收率的影响最明显，因此本实验对该三因素进行了优化。

2.2.1上样溶剂对回收率的影响分别以乙腈、二氯甲烷和双蒸水为上样溶剂，收集上样流出液，通过高效液相色谱法测定上样流出液中盐酸克伦特罗的含量。图3是3种上样溶剂流出液中盐酸克伦特罗的回收率，当采用双蒸水为上样溶剂时，流出液中盐酸克伦特罗的含量非常少，为1.87 %，说明盐酸克伦特罗被特异性吸附在分子印迹固相萃取柱的填料中。而采用乙腈作为上样溶剂时，流出液中有较多的盐酸克伦特罗被测出，含量约为23.45%，说明盐酸克伦特罗不能在乙腈溶剂中被特异性吸附。二氯甲烷作为上样溶剂时,其保留性介于双蒸水和乙腈之间。由于双蒸水的保留效果最好，因此实验采用双蒸水作为上样溶剂。

2.2.2上样速度对回收率的影响考察了不同上样速度(0.6，0.8，1.0，1.2 mL/min)对回收率的影响。准确移取5.0 mL样液分两次加于固相萃取小柱，通过真空阀调节压力，控制不同流速，收集上样流出液，氮气吹干，采用1 mL甲醇超声波溶解，高效液相色谱分析。结果表明，随着上样速度的增加盐酸克伦特罗的回收率下降，当上样速度为0.6 mL/min时，其回收率最高(92.3%)，但相对耗时；而上样速度大于1.0 mL/min时，回收率低于90%。因此实验选择上样速度为0.6 mL/min。

2.2.3洗脱溶剂对回收率的影响分别比较了甲醇、甲醇-10%乙酸和1%三氟乙酸的甲醇溶液对目标化合物的洗脱效果。结果显示，3种洗脱溶剂均有一定的洗脱效果(回收率均大于60%)，但1%三氟乙酸的甲醇溶液洗脱效果更好，回收率较高(达95.3%)，因此选择1%三氟乙酸的甲醇溶液作为洗脱溶剂。

2.3线性范围与相关系数

将标样储备液配制成5个不同浓度的工作液，在优化条件下进行高效液相色谱分析，每个浓度重复测定3次，以化合物的浓度(x,μg/mL)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线。实验表明，盐酸克伦特罗在0.432~4.32 μg/mL范围内线性关系良好，线性方程为y=30 358x-307.74，相关系数(r)为0.999 0。

表1　盐酸克伦特罗的加标回收率及相对标准偏差(n=3)

2.4加标回收率、检出限与定量下限

取10 g猪肝空白样品，分别加入标准品0.216，0.432，0.864 μg，按照“1.2.2”方法进行样品预处理。每个添加量做3次平行，计算其平均回收率，实验结果见表1。在3个加标水平下，盐酸克伦特罗的平均回收率为84.7%~92.0%，相对标准偏差(RSD)为1.5%~1.8%，符合残留分析要求。回收率的结果与钱鸣蓉等[17]采用液相色谱-串联质谱法的测定结果(方法的回收率为82%~90%)接近。加标样品色谱图如图4所示。根据信噪比(S/N=3)计算检出限(LOD)为0.02 μg/mL。以每次进样体积为10 μL计算，定量下限(LOQ，S/N=10)为0.34 μg/mL。

3结论

本文建立了分子印迹固相萃取/高效液相色谱测定猪肝中盐酸克伦特罗残留量的分析方法。实验对国标GB/T 5009.192-2003方法中的流动相做了调整，优化了Supelco MIP-clenbuterol分子印迹固相萃取条件。在优化条件下测定加标猪肝样品中盐酸克伦特罗的残留量，测定平均回收率为84.7%~92.0%，相对标准偏差为1.5%~1.8%，方法的准确度及精密度结果满足兽药残留的分析要求。

参考文献：

[1]Lohmann F W，Loesment W A,Kaehler H.J.Cardiov.Pharm.,1990，16(5)：45-52.

[2]Yang H F,Yan L.EndemicDiseasesBulletin(杨浩峰，严蕾.地方病通报),2006，21(1)：101-104.

[3]Bilkoo P,Thomas J,Riddle C D,Kagaoan G.ConnecticutMedicine,2007,71(2):89-91.

[4]Wang X N.ImmunityandToxicPathologicalStudyofβ-AdrentrgicAgonistClenbuterol.Changchun:The University of Chinese People’s Liberation Army Military(王选年.β-肾上腺素受体激动剂盐酸克伦特罗的免疫特性及中毒病理学研究.长春：中国人民解放军军需大学)，2002:5.

[5]Wang P L，Fan L，Song R.Chin.J.Anal.Chem.(王培龙，范理，宋荣.分析化学)，2007,35(9):1319-1322.

[6]Li C,Wu Y L,Yang T.J.Chromatogr.A,2010,1217(50):7873-7877.

[7]Aresta A,Calvano C D,Palmisano F.J.Pharm.Biomed.Anal.,2008,47:641-645.

[8]Tang Y,Lan J, Gao X.FoodChem.,2016,190:952-959.

[9]The Ministry of Health of the People’s Republic of China.China Patent(中华人民共和国卫生部，中国专利).GB/T 5009.192-2003，2004-01-01.

[10]Zhang X L，Sun R N，Yang X D.J.Instrum.Anal.(张晓蕾，孙如宁，杨小弟.分析测试学报),2015,34(2)：159-163.

[11]Feng T，Hu Y F，Li G K.J.Instrum.Anal.(冯婷，胡玉斐，李攻科.分析测试学报)，2011，3(10)：1191-1198.

[12]Liu K F，Chen J，Chen N,Hu M,Gong W J，Zhang Y P.J.Instrum.Anal.(刘坤峰,陈军,陈娜,胡梅,龚文君,张裕平.分析测试学报)，2014，33(8)：859-865.

[13]Ding F L，Zhang C H，Tan S G，Liao S S.FoodandMachinery(丁芳林，张朝辉，谭胜国，廖三赛.食品与机械)，2007，23(5)：112-113.

[14]Zong W L,Liu X C.MeatRes.(宗万里，刘新才.肉类研究)，2011，25(4)：30-32.

[15]Zhang Q,Liu Y.Mod.FoodSci.Technol.(张群，刘烨.现代食品科技)，2009,25(3):337-340.

[16]Gu G P，Wang S，Zhou Y L，Zhou J C，Zhou L Y.ZhejiangAgric.Sci.(顾国平,王森，周亚莲，周建昌，周丽燕.浙江农业科技)，2008，(5)：624-626.

[17]Qian M R，Wu L Q，Zhang H，Liu F，Li R,Chen Z M，Li T，Fang L Z.J.Instrum.Anal.(钱鸣蓉，吴俐勤，章虎，刘飞，李锐，陈志民，李婷，方丽珍.分析测试学报)，2011，30(9)：1018-1022.

Study on Residue Determination of Clenbuterol in Pork Liver by Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction/High Performance Liquid ChromatographyTANG Kai-jie1,2,LUO Qiu-shui1,2*,YU Rui-long1,2,WU Qiu-hao1,2

(1.College of Food Science and Engineering of Jiangxi Agricultural University,Nangchang330045,China;2.Key Lab

of Agricultural Products Processing and Quality Control of Nanchang City,Nangchang330045,China)

Abstract：A molecularly imprinted solid phase extraction coupled with high performance liquid chromatographic (HPLC) method was firstly developed for the determination of clenbuterol hydrochloride residues in pork liver.The chromatographic conditions were as follows:the column:ASB C18column(250 mm × 4.60 mm,5 μm),mobile phase:methanol-water (45∶55,pH 3.0),UV detection wavelength:243 nm,sample volume:10 μL,flow rate:0.6 mL/min,column temperature:30 ℃.Molecularly imprinted solid phase extraction conditions were as follows:solvent of sample loading:double distilled water,flow rate of loading:0.6 mL/min;elution solvent:methanol solution containing 1%trifluoroacetic acid.Under the optimal conditions,the calibration curve was linear in the range of 0.432-4.32 μg/mL,with linear equation of y=30 358x-307.74(r=0.999 0).The spiked recoveries were in the range of 84.7%-92.0%,with RSDs of 1.5%-1.8%.The accurancy and precision of the method could satisfy the requiremennts for residuals analysis.

Key words：molecularly imprinted solid phase extraction;high performance liquid chromatography(HPLC);pork liver;clenbuterol hydrochloride

中图分类号：O657.72；TQ460.72

文献标识码:A

文章编号：1004-4957(2016)01-0115-04

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.01.020

通讯作者：*罗秋水，硕士，实验师，研究方向：食品质量与安全，Tel：15979009720，E-mail：tkjie999@sina.com

基金项目：江西省科技厅支撑项目(2010BSA17500)

收稿日期：2015-07-23；修回日期：2015-08-13