超高压液相色谱-串联质谱法测定畜禽粪便中3种β-受体激动剂残留

石　奥

(北京市畜牧业环境监测站，北京　102200)



超高压液相色谱-串联质谱法测定畜禽粪便中3种β-受体激动剂残留

石奥*

(北京市畜牧业环境监测站，北京102200)

β-受体激动剂俗称“瘦肉精”，可促进蛋白质的合成，加速脂肪的转化和分解，提高动物的瘦肉率，常见的“瘦肉精”有克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等。尽管农业部已于1997年严禁将包括克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇在内的β-受体激动剂作为动物促生长剂使用，但近年来持续发生瘦肉精中毒事件，例如2010年9月8日深圳商报报道深圳出现食用蛇肉瘦肉精中毒事件，2011年央视315特别行动节目曝光双汇使用“瘦肉精”猪肉事件，2012年12月6日南方周末报道湖南出现牛肉瘦肉精超标事件等。β-受体激动剂在猪、牛以及禽类上均出现违规使用现象。人食用含β-受体激动剂的食品会出现心跳加快、心悸等症状，严重者会导致癌变。β-受体激动剂在动物体内的吸收率低，大部分以原药形式排出体外，通过尿液和粪便进入环境，造成水体、土壤污染。

当前的研究侧重于畜禽尿液中β-受体激动剂残留对环境的影响，相对于尿液，粪便作为畜禽主要排泄物更易获得，且稳定性及代表性更强，但相关报道较少。1996年Batjoens等[1]采用气相色谱-质谱联用仪检测动物粪便中的克伦特罗，2014年李丹妮等[2]采用在线净化液相色谱-质谱联用仪检测畜禽粪便中7种β-受体激动剂，侧重于研究苯胺型β-受体激动剂。开展畜禽粪便中多种类型β-受体激动剂残留检测技术的研究，对分析其进入环境中产生的污染风险具有重要意义。目前，β-受体激动剂残留的检测方法有酶联免疫法、高效液相色谱法[3]、气相色谱-质谱联用法[1，4-6]、液相色谱-质谱联用法[2，7-9]。相比较而言，酶联免疫法的误差较大，一般只能定性；高效液相色谱法易受干扰成分影响，低含量时易出现假阳性样品；气相色谱-质谱联用法准确度较高，但前处理需衍生，操作较为繁琐，检测结果的稳定性较差；而液相色谱-质谱联用法的准确度高、检出限低，基质干扰较小，选择性强、上机检测简便快速，在β-受体激动剂的检测中得到了更广泛的应用。

本文旨在使用液相色谱-质谱联用仪建立畜禽粪便中多种β-受体激动剂残留的检测方法，既能覆盖苯胺型和苯酚型两种类型的β-受体激动剂以提高方法的适应性，又能提高检测效率以及获得稳定的回收率，为β-受体激动剂在环境中的残留分析和风险评价提供了基础依据。

1实验部分

1.1仪器与试剂

XEVO TQ-S三重四极杆液相色谱质谱联用仪(美国 Waters公司)；T18高速分散器(德国IKA公司)；WD-12水浴氮吹仪(杭州奥盛仪器有限公司)；FE20 pH计(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；KH-100PE数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；TDL-40B型低速离心机、GL-20B型 高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；THZ-82气浴恒温振荡器(常州国华电器有限公司)；LGJ-12冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)；QL-861漩涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；负压固相萃取装置(天津博纳艾杰尔科技有限公司)；MCX固相萃取柱(60 mg，3 mL，德国CNW公司)。

克伦特罗盐酸盐(CLE,C11668550)、莱克多巴胺盐酸盐(RAC,C16805000)、沙丁胺醇(SAL,C16903000)(德国Dr.Ehrenstorfer公司)；克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D3、沙丁胺醇-D3(加拿大CDN公司)；β-葡萄糖醛苷酸酶：>100 000 units/mL(德国Merck公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；高氯酸(分析纯，金鹿化工有限公司)。

1.2标准溶液的配制

准确称取适量的克伦特罗盐酸盐、莱克多巴胺盐酸盐、沙丁胺醇、克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D3、沙丁胺醇-D3标准品，用甲醇分别配制成100 μg/mL的标准贮备液，置于-18 ℃冰箱保存。准确移取各种单标贮备液，配制各种浓度的混合标准液和混合内标液，备用。

1.3样品采集与制备

选取北京规模化猪场、鸡场、牛场，采集新鲜粪便，多点采样混合[10]，制成约500 g的代表性样品，现场于4 ℃以下冷藏保存，尽快运回实验室，冷冻储存。将经冷冻干燥处理后的样品用研钵研磨，过1 mm筛制备检测样品，避光保存并测定含水率。

1.4样品前处理

准确称取2.00 g畜禽粪便样品，置于50 mL离心管中，加入10 mL乙酸钠缓冲盐(pH 5.2)，充分混匀，加入5 μLβ-葡萄糖醛苷酸酶，混匀，37 ℃气浴避光振荡水解16 h。酶解后置于室温，加入50 μL 100 μg/L的内标混合液于待测样品中，加盖涡旋混匀，加高氯酸调节pH值至1.0±0.1，8 000 r/min高速离心5 min，取上清液。用10 mol/L NaOH溶液调节pH值至11.0，8 000 r/min高速离心5 min，取上清液。加入10 mL乙酸乙酯，涡旋混匀，振荡10 min，8 000 r/min高速离心5 min，取上清液。残液中加入10 mL乙酸乙酯再提取1次，合并上清液，50 ℃氮气吹干，1 mL 0.1%甲酸-水定容，超声混匀1 min，过0.22 μm微孔滤膜净化，待测。

1.5仪器条件

1.5.1超高压液相色谱条件采用BEH C18色谱柱(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)，流动相：乙腈(A)和0.1%甲酸-水(B)，流速0.3 mL/min，柱温40 ℃。梯度洗脱程序为：0 ~2 min,5%~40%A;2 ~3 min,40%~95%A;3 ~3.1 min,95%A;3.1 ~4 min,95%~5%A。

1.5.2质谱条件离子源：电喷雾离子源；电离方式：ESI；扫描方式：正离子；监测方式：多离子反应监测(MRM)；离子源温度：150 ℃。根据欧盟指令[11]规定：为确保质谱检测的可信度，低分辨质谱联用检测应选择检测化合物1个母离子和2个以上的子离子。在确定各物质的母离子基础上，经Daughter-scan方式选择子离子的质量数及最佳碰撞能量，建立MRM模式，相关质谱参数见表1。

表1　3种β-受体激动剂和相应内标物的质谱参数

*quantitative ion(定量子离子)

2结果与讨论

2.1提取液的选择

根据苯环上取代基的差异，β-受体激动剂可分为苯胺型和苯酚型。苯胺型结构中具有芳伯胺基，中等极性，如克伦特罗；苯酚型一般具有邻(间)苯二酚或苯酚结构，由于含有胺基和酚羟基，故具有较高极性，沙丁胺醇和莱克多巴胺属于苯酚型。苯酚型的轭合代谢过程较强，沙丁胺醇的代谢物主要以硫酸轭合物的形式存在，其次为葡萄糖醛酸轭合物，莱克多巴胺主要以葡萄糖醛酸轭合物形式存在[12]，所以，苯酚型β-受体激动剂需通过酸性水溶液水解和酶解解离，使其转化为代谢前的化合物后再进行提取，而文献[1-2]只针对苯胺型β-受体激动剂，无需此过程。

表2　猪粪中3种β-受体激动剂的绝对回收率

畜禽粪便样品的成分非常复杂，特别是有机质含量特别高[13]，仅通过高氯酸水解[14]很难将样品净化提取，必须转化到碱性条件下，通过有机溶剂进一步净化提取。常用的液液萃取剂[15]有乙腈、乙醚、乙酸乙酯、叔丁基甲醚等，也有采用混合溶剂萃取的研究，如乙酸乙酯-异丙醇(60∶40)[9]、乙酸乙酯-丁醇、乙醇-水[16]等。本文比较了不同提取液对畜禽粪便中β-受体激动剂残留的提取效果，提取液包括乙腈、异丙醇、叔丁基甲醚、乙酸乙酯、乙酸乙酯-异丙醇(60∶40)。以添加绝对回收率(同等浓度，加标样品的峰面积/溶于基质空白溶液中样品的峰面积×100%)为指标，考察了上述5种提取液对畜禽粪便中1 μg/kg的克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的提取效果，结果表明：用异丙醇、乙酸乙酯-异丙醇(60∶40)提取的样品中杂质较多，基体干扰严重，克伦特罗和莱克多巴胺的回收率<10%，沙丁胺醇的回收率为0%；叔丁基甲醚提取样品的回收率小于15%,回收率均过低；乙腈和乙酸乙酯提取的样品杂质较少，回收率较高，分别可达到35.2%~55.3%和38.1%~52 .1%，但乙腈不易挥发，难以吹干浓缩样品，前处理时间较长。综合比较而言，乙酸乙酯的提取效果较好，实验结果见表2。由表2可以看出，苯胺型β-受体激动剂的极性较弱，采用极性有机溶剂提取时，回收率较好；而苯酚型β-受体激动剂的极性较强，提取回收率差。由于样品基质复杂，需要较为复杂的前处理净化和降低基质干扰，导致样品的绝对回收率较低，无法满足外标法测定时对回收率的要求(60%~120%)，需通过内标法来降低前处理过程中样品的损失和基质的影响。

2.2固相萃取与液液萃取的比较

基质效应是指在样品测试过程中，待测物以外的其他物质的存在，直接或间接影响待测物响应的现象[17]。采用液质联用方法检测瘦肉精时，由于基质抑制效应明显，普遍采用内标法降低基质效应的影响，适当的前处理方法也有利于降低基质效应，但前处理方法过于复杂会降低检测效率，增加污染的风险，造成目标组分的损失，降低目标组分的回收率。本实验以添加2 μg/kg克伦特罗的猪粪为参照，比较了液液萃取及固相萃取(样品经MCX柱净化)的加标回收率，两者的相对回收率((加标样品的峰面积/加标样品内标物的峰面积)/(溶于空白基质溶液中样品的峰面积/溶于空白基质溶液中内标物的峰面积)×100%)分别为95.4%和96.3%，相差不大，表明采用固相萃取后，基质效应未明显改善。而固相萃取后的绝对回收率为32.8%，较液液萃取的绝对回收率(37.5%)有所降低，可见经过固相萃取后，待测组分有更多损失。一般质谱类实验要求回收率在60%~120%之间，从检测结果看，两种处理方式的绝对回收率都无法满足实验要求(<60%),通过内标法定量，液液萃取和固相萃取均可满足检测要求(60%~120%)。而固相萃取因操作繁琐、耗时、成本高，对检测结果无明显改善，所以本实验采用液液萃取，在满足实验要求的同时，又可节省成本和时间。

2.3色谱条件的优化

比较了甲醇和乙腈作为流动相中的有机相时对目标物分离效果和响应值的影响。结果发现，乙腈作为有机相可获得更好的分离效果和检测灵敏度。在流动相的水相中加入甲酸，可增加其在ESI+模式下的离子化效率。本实验分别配制0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%的甲酸水溶液和乙腈作为流动相，考察了甲酸浓度对待测物分离效果的影响。结果表明，加入0.1%的甲酸时能获得最好的分离效果，同时可获得较好的离子化效率。经过反复优化，确定了“1.5.1”所述梯度洗脱条件。图1为优化条件下，3种化合物在多反应监测模式(MRM)下的特征离子质量色谱，可观察到3种化合物在2 min内出峰并且分离效果理想。

表3　3种β-受体激动剂的线性方程、相关系数及检出限

2.4线性范围与检出限

用基质溶液配制质量浓度分别为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 μg/L的系列标准溶液，加入50 μL 100 μg/L的内标混合液，定容至1.0 mL，上机测定。以浓度(X，μg/L)为横坐标，分析物峰面积与内标物峰面积的比值(Y)为纵坐标绘制标准曲线。3种β-受体激动剂在0.5 ~20.0 μg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数(r2)均大于0.998。采用空白样品添加3种β-受体激动剂的方法，根据信噪比S/N≥3确定方法检出限(LOD)，得到畜禽粪便样品中沙丁胺醇、莱克多巴胺、克伦特罗的检出限分别为0.04，0.06，0.07 μg/kg(表3)。β-受体激动剂作为我国明令禁用的兽药，中国人民共和国农业部第235号公告[18]中规定在所有食品中不得检出，因此在实际检测中对检出限要求较高，参考农业部1025号公告-18-2008[19]的检出限(0.25 μg/kg)，本方法的检出限均低于0.25 μg/kg，满足畜禽粪便中β-受体激动剂的检测要求。

2.5回收率与精密度

准确称取猪粪、牛粪、鸡粪阴性样品进行加标回收率与精密度实验，加标水平为1，2，5 ng，每个水平做3个平行，结果见表4。结果表明，3种β-受体激动剂的平均回收率为80.3%~110.2%，相对标准偏差(RSD)为3.0%~7.7%。可见本方法的准确度和精密度均可满足畜禽粪便中瘦肉精残留的检测要求。

2.6实际样品的分析

在北京郊区采集16家规模化畜禽养殖场的畜禽粪便样品，其中猪场8家、鸡场5家、牛场3家。

表4　3种β-受体激动剂的平均回收率与相对标准偏差(n=3)

采用本方法对所采集样品进行测试，每个样品做2个平行，结果所有样品中均未检出克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺。

3结论

本文建立了超高压液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定畜禽粪便中3种β-受体激动剂残留的检测方法。采用液液萃取的前处理方法，省去了固相萃取净化样品的步骤，节省了时间，降低了成本。通过内标物的使用弥补了基体抑制效应和前处理过程中被测物损失对定量结果的影响，该方法灵敏度高，适用范围广，具有较好的稳定性，适用于各类畜禽粪便中β-受体激动剂残留的检测。

参考文献：

[1]Batjoens P,Courtheyn D,De Brabander H F,Vercammen J,De Wasch K,Logghe M.J.Chromatogr.A，1996,750(1/2):133-139.

[2]Li D N,Yan F,Wu J P,Zhou Y R,Gu X,Zhang X.Chin.J.Anal.Chem.(李丹妮，严凤，吴剑平，周悦榕，顾欣，张鑫.分析化学)，2014，42(12)：1797-1803.

[3]Dai H,Yuan Z N,Huang Z Q,Chen X H.J.Instrum.Anal.(戴华,袁智能,黄志强,陈新焕.分析测试学报),2003，22(3)：57-60.

[4]Kong Y,Qiu Y M,Li P,Shen J Z.J.Instrum.Anal.(孔莹,邱月明,李鹏,沈建忠.分析测试学报),2010，25(2)：63-66.

[5]Tian M.J.Instrum.Anal.(田苗.分析测试学报)，2010，29(7)：712-716.

[6]Wang P L,Fan L,Song R,Gao S,Su X O,Yang S M.Chin.J.Anal.Chem.(王培龙，范理，宋荣，高生，苏晓鸥，杨曙明.分析化学)，2007，35(9)：1319-1322.

[7]Zhu W X,Yang J Z,Guo H L,Zhang L,Wang C J,Zhang L.J.Instrum.Anal.(祝伟霞，杨冀州，郭慧领，张莉，王彩娟，张丽.分析测试学报),2015，34(7)：802-806.

[8]Mi J B,Li S J,Wang F,Dong X C,Xu H,Ge B K,Chen Q Y.J.Instrum.Anal.(宓捷波,李淑静,王飞,董襄朝,许泓,葛宝坤,陈其勇.分析测试学报),2014，33(12)：1356-1361.

[9]Wang Y,Xing L J,Hao J Y,Lu L L,Tang Z G,Luo X L.FoodSci.(王远，邢丽杰，郝家勇，鲁立良，唐宗贵，罗小玲.食品科学)，2012，34(8)：216-219.

[10]GB/T 25169-2010.Technical Specifications for Monitoring of Animal Manure.National Standards of the People’s Republic of China(畜禽粪便监测技术规范.中华人民共和国国家标准).

[11]Commission Decision of 12 August 2002 Implementing Council Directive 96 23 EC Concerning the Performance of Analytical Methods and the Interpretation of Results(2002 657 EC),12.8.2002.

[12]Li J S,Qiu Y M，Wang C.ResidueAnalysisforVeterinaryDrug.Shanghai:Shanghai Scientific and Technical Publishers(李俊锁,邱月明,王超.兽药残留分析.上海:上海科学技术出版社)，2002:641-658.

[13]Li Y X,Li W,Zhang X L,Yang M.Chin.J.Anal.Chem.(李艳霞，李帷，张雪莲，杨明.分析化学)，2012，40:213-217.

[14]Zhai S P,Zhou D G,Sun Z W,Yan X F,Zhang L Y,Zuo W X.ChinaJ.Veter.Med.(翟淑平,周德刚,孙志文,闫小峰,张连彦,左文霞.中国兽药杂志)，2007,41(12)：24-26.

[15]Wang G M,Li Y G,Xi C X,Zhang J Z,Li Z G.FoodInd.Technol.(王国民，李应国，郗存显，张进忠，李正国.食品工业科技)，2011，(4)：400-404.

[16]Wang W,Zhang Y,Wang J,Shi X,Ye J.MeatSci.,2010,85(2):302-305.

[17]FDA Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation,US Department of Health and Human Services,Food and Drug Administration,Center for Drug Evaluation and Research (CDER),2001.

[18]No.235 Bulletin of the Ministry of Agriculture of the People’s Republic of China.Maximum Residue Limits of Veterinary Drugs in Animal Food(中华人民共和国农业部公告第235号.动物性食品中兽药最高残留限量)，2002.

[19]No.1025 Bulletin-18-2008 of the Ministry of Agriculture of the People’s Republic of China.Determination ofβ-Agonists Residues in Animal Derived Food by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry.National Standards of the People’s Republic of China(农业部1025号公告-18-2008.动物源性食品中β-受体激动剂残留检测 液相色谱-串联质谱法.中华人民共和国国家标准).

摘要：建立了畜禽粪便中3种β-受体激动剂药物残留的超高压液相色谱-串联四极杆质谱联用仪测定方法。样品酶解后经高氯酸溶液净化，调节pH值至碱性，乙酸乙酯提取，净化浓缩后以流动相定容，用超高压液相色谱-质谱联用仪检测，内标法定量。3种β-受体激动剂在0.5 ~20.0 μg/L范围内线性关系良好，相关系数均大于0.998。畜禽粪便中3种β-受体激动剂的加标回收率为80.3%~110.2%，相对标准偏差为3.0%~7.7%，检出限(S/N=3)为0.04 ~0.07 μg/kg。

关键词：超高压液相色谱-串联四极杆质谱联用仪;畜禽粪便;β-受体激动剂;内标法

Determination of 3β-Agonists in Animal Manure by Ultra High Performance Liquid Chromatography and Mass SpectrometrySHI Ao*

(Beijing Monitoring Station for Animal Husbandry Environment,Beijing102200,China)

Abstract：A method for the simultaneous determination of 3 β-agonists in animal manure was studied by ultra high performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization triple-quadruple tandem mass spectrometry(UPLC-ESI MS/MS).The drugs were cleaned up with perchloric acid solution after enzymolysis and adjusting pH to alkaline.The purified analyte was extracted with ethyl acetate.The extract was evaporated to dryness under nitrogen,and reconstituted in mobile phase solution.The target compounds were confirmed and quantified by UPLC-ESI MS/MS with the internal standard method.Under the optimal conditions,the calibration curves of 3 β-agonists showed good linearities in the range of 0.5-20.0 μg/L with correlation coefficients more than 0.998.The average recoveries of 3 β-agonists were in the range of 80.3%-110.2%,and the relative standard deviations(RSDs) were 3.0%-7.7%.The limits of detection(S/N=3) ranged from 0.04 μg/kg to 0.07 μg/kg.

Key words：ultra high performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization triple-quadruple tandem mass spectrometry(UPLC-ESI MS/MS);animal manure;β-agonists;internal standard method

中图分类号：O657.63

文献标识码:A

文章编号：1004-4957(2016)01-0074-05

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.01.012

通讯作者：*石奥，硕士，研究方向：畜禽养殖产地环境，Tel:010-28348303，E-mail:stoneao12@sohu.com

基金项目：北京市农委 (PXM2014 036240 000012)

收稿日期：2015-07-08；修回日期：2015-08-07