铜绿假单胞菌脂多糖对白念珠菌生物膜形成的影响

邓娟 孙伟 苏建荣

(首都医科大学附属北京友谊医院临床检验中心，北京 100050)

·论著·

铜绿假单胞菌脂多糖对白念珠菌生物膜形成的影响

邓娟 孙伟 苏建荣

(首都医科大学附属北京友谊医院临床检验中心，北京 100050)

目的 研究铜绿假单胞菌脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)对白念珠菌生物膜形成不同时期的影响。方法 甲基四氮盐 (XTT)减低法用于检测铜绿假单胞菌LPS对白念珠菌生物膜形成不同阶段生成量的影响，利用倒置显微镜观察生物膜形态学改变。结果 铜绿假单胞菌对白念珠菌生物膜形成的影响具有阶段差异性和浓度差异性。结论 铜绿假单胞菌LPS抑制白念珠菌生物膜菌丝的形成。

铜绿假单胞菌；脂多糖；白念珠菌；生物膜

[Chin J Mycol，2016，11(6):337-340]

念珠菌与革兰阴性杆菌败血症是危重患者重要致死原因之一。近年来，由于各种体内植入物 (如心脏支架、口腔种植材料、导尿管等)、抗生素的滥用、HIV感染及应用免疫抑制剂等因素，白念珠菌血症感染率逐年升高[1]。白念珠菌能够黏附在导尿管、心脏支架、静脉插管、人工关节等人体植入物上形成生物膜[2]，从而对机体造成损害及对抗真菌药物产生明显耐药性[3]。因此，减少或阻断生物膜的形成可以有效提高抗真菌治疗效果，提高患者生存率。

铜绿假单胞菌是人体常见的机会致病菌，也是医院获得性血流感染的常见致病菌，而脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)是铜绿假单胞菌的主要致病成分之一，是革兰阴性杆菌细胞壁的特有结构，又名内毒素，其可通过促炎反应和免疫调节机制引起发热、糖代谢紊乱、内毒素休克等[4]。脂多糖促炎性在脓毒症休克致病机制中起着重要作用[5]。尽管脂多糖对白念珠菌生物膜形成的体外实验数据较少，但许多体内研究表明脂多糖对白念珠菌感染的影响[6-7]。

本研究通过构建体外白念珠菌生物膜模型，采用甲基四氮盐 (XTT)法检测不同浓度铜绿假单胞菌脂多糖对白念珠菌生物膜形成的影响，期望能为临床治疗混合性感染提供一定帮助，也期望能为研发新型抗真菌药物提供一定的实验室依据。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株 白念珠菌标准菌株ATCC 90028 1株 (受赠于首都医科大学附属北京佑安医院临床检验中心微生物室)，白念珠菌标准菌株SC5314 1株，临床血培养阳性标本分离的32株白念珠菌，均来自首都医科大学附属北京友谊医院临床检验中心细菌室，使用前脱脂牛奶-70℃保存。

培养基 沙氏培养基 (SDA)购自Oxiod公司；RPMI-1640培养液购自Gibco公司；酵母氮源培养基 (Yeast nitrogen medium，YNB)购自Difco公司，称取YNB 3.35 g、葡萄糖10 g，加蒸馏水定容至500 mL，0.45 μm微孔滤器过滤除菌，4℃保存。

主要试剂 铜绿假单胞菌LPS、甲基四氮盐 (XTT)、甲萘醌均购自Sigma公司：LPS用RPMI-1640溶液调整成100 μg/mL～0.001 μg/mL浓度；XTT用无菌PBS缓冲液 (购自Solarbio公司)稀释配成0.5 mg/mL饱和溶液，0.22 μm微孔滤器过滤除菌，分装后-20℃冰箱冻存；甲萘醌用丙酮 (北京化学试剂厂，分析纯)新鲜配制成浓度为10 mmol/L溶液。

仪器 恒温摇床，酶标仪，细胞计数板，倒置显微镜 (Olympus，日本)。

1.2 方法

念珠菌生物膜的制备 将从-70℃冰箱保藏的待测菌株接种于SDA培养基上，37℃、5%CO2培养18 h。取一接种环菌量至YNB培养液中，37℃摇床 (75 r/min)培养过夜，离心，弃上清，PBS液离心洗涤2次 (4 000 r/min，5 min)。用含或不含有不同浓度LPS (100 μg/mL～0.001 μg/mL)RPMI-1640液体培养基稀释菌液，显微镜下用细胞计数板将菌液浓度调整至5×106cells/mL。取100 μL上述菌液接种至无菌96孔板中，37℃摇床 (75 r/min)培养90 min，然后用PBS轻轻洗涤2次，以洗掉未黏附的念珠菌细胞，再加入含或不含不同浓度LPS (100 μg/mL～0.001 μg/mL)RPMI-1640液体培养基200 μL，继续培养24 h和48 h，每隔24 h换液1次。阴性对照孔为不含LPS的RPMI-1640培养基。实验在不同时间重复3遍。

XTT减低法进行生物膜定量分析 在90 min、24 h、48 h时刻点，弃去96孔板中培养液，每孔用200 μL PBS缓冲液洗2遍，然后每孔加入40 μL XTT、2 μL甲萘醌、158 μL PBS缓冲液，37℃避光孵育3 h后，用酶标仪测定念珠菌生物膜在490 nm处的吸光度值 (A值)。

倒置相差显微镜观察生物膜形态 按上述方法进行念珠菌生物被膜的制备，24 h后于倒置显微镜下观察念珠菌生物膜形态并拍摄照片。

1.3 统计学分析

用SPSS 17.0进行统计学分析。数据用均值±SD表示，白念珠菌生物膜量实验组与对照组的比较用Student'st检验，P<0.05认为有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度铜绿假单胞菌LPS对念珠菌生物膜形成的影响

本实验选取了一系列不同浓度的铜绿假单胞菌脂多糖，研究显示：与对照组相比，实验组在黏附阶段 (90 min)，铜绿假单胞菌脂多糖对白念珠菌生物膜生成量具有菌株差异性和脂多糖浓度差异性；在生物膜形成阶段 (24 h)和生物膜成熟阶段 (48 h),铜绿假单胞菌脂多糖100 μg/mL浓度对白念珠菌生物膜形成抑制率最高，分别为94.1% (32/34)和82.4% (28/34)(见表1)。

表1 不同浓度铜绿假单胞菌LPS影响白念珠菌生物膜形成的菌株数

Tab.1 The effect of different concentrations ofPseudomonasaeruginosaLPS influenceCandidaalbicansbiofilms formation (strains)

阶段影响铜绿假单胞菌LPS(μg/mL)1001010.10.010.00190min+463535-181612787/12121922232224h+000000-3230211864/241316283048h+000000-2822181220/61216223234

注："+"表示刺激；"-"表示抑制；"/"表示无影响

2.2 铜绿假单胞菌脂多糖对白念珠菌生物膜形态的影响

用包含不同浓度铜绿假单胞菌脂多糖的RPMI-1640溶液培养24 h后，通过倒置显微镜观察发现，白念珠菌对照组形成的生物膜中含有大量呈交织状态的菌丝，而实验抑制组生物膜多数为酵母相，偶见少量菌丝形成 (见图1)。

图1 铜绿假单胞菌脂多糖对白念珠菌ATCC 90028菌株生物膜形成的影响：a.对照组 (×40倍),b.脂多糖100 μg/mL (×40倍)

Fig.1 Effect of 100 μg/mLPseudomonasaeruginosalipopolysaccharide onC.albicansATCC 90028 hyphal growth.C.albicansATCC 90028 cells were grown in RPMI-1640 medium at the 100 μg/mL concentration ofPseudomonasaeruginosaLPS at 37℃ for 24h.At the end of incubation an aliquot was withdrawn from each sample and photographed at 40×magnification

3 讨 论

白念珠菌是一种二相型真菌，可在孢子相和菌丝相间进行形态学转换。它在自然界中以浮游状态或者生物膜状态生长，不同的生长状态呈现出不同的生物学特性。临床上，大部分白念珠菌感染以生物膜形态发生。成熟的白念珠菌生物膜是一个由孢子、假菌丝及菌丝形成的致密网状结构，可使得白念珠菌致病性增强[8]，导致生物膜状态白念珠菌血症成为临床治疗的难点。

1994年，Kerr[9]首次描述了铜绿假单胞菌的体内抗真菌活性。他随访了3位术后肺部感染患者，发现当患者感染铜绿假单胞菌时，痰培养中并未分离出白念珠菌；但当用有效抗生素治疗铜绿假单胞菌感染后，患者痰中可分离培养出白念珠菌，由此认为铜绿假单胞菌对白念珠菌的生长抑制作用。Gupta等[10]对300位烧伤患者进行了长达2 a时间的随访，通过从烧伤创面上收集的不同种类的细菌对白念珠生长的影响确定体内细菌的存在是否影响念珠菌的生长，结果观察到铜绿假单胞菌对念珠菌的抑制作用。Azoulay等[11]报道了机械通气患者白念珠菌的定植与铜绿假单胞菌肺炎发生的正相关性。Sabra等[12]阐述了2种不同化学类型的铜绿假单胞菌脂多糖在一定生存条件下，脂多糖表型的改变可能在细菌黏附和存活过程中起着重要作用。Bandara等[13]报道了通过共聚焦荧光显微镜和扫描电镜观察到铜绿假单胞菌脂多糖抑制白念珠菌菌丝的形成从而影响白念珠菌生物膜的形成。

念珠菌生物膜的形成阶段，可人为地划分为3个阶段：黏附阶段 (1～2 h)、生物膜形成阶段 (12～24 h)和生物膜成熟阶段 (30～72 h)[14]。本实验结果显示，铜绿假单胞菌脂多糖对白念珠菌生物膜的形成具有抑制作用，并具有浓度依赖性。倒置显微镜下观察其形态学改变，可发现铜绿假单胞菌脂多糖抑制白念珠菌菌丝形成。本实验结果，与Bandara等[13]所报道有所差异，可能与实验对照组设置及试验方法不同有关。本研究不足之处在于尚未验证不同浓度铜绿假单胞菌脂多糖对白念珠菌的毒性作用。

Bandara等[13]的发现及本实验结果提示铜绿假单胞菌脂多糖具有一定的抗真菌效果。铜绿假单胞菌脂多糖对白念珠菌菌丝及生物膜影响的分子机制，值得进一步研究，从而揭示去毒性的铜绿假单胞菌脂多糖是否可以成为抗真菌药物。

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[本文编辑] 卫凤莲

·消息·

Effect ofPseudomonasaeruginosalipopolysaccharide on biofilm formation ofCandidaalbicans

DENG Juan，SUN Wei，SU Jian-rong

(ClinicalLaboratoryCenter，BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050)

Objective To explore the effect ofPseudomonasaeruginosalipopolysaccharide onCandidaalbicansbiofilm formation.Methods XTT reduction assay was used to elucidate the effect ofPseudomonasaeruginosalipopolysaccharide on biofilm formation ofCandidaalbicans.Result These date are indicative thatPseudomonasaeruginosalipopolysaccharide modulateCandidabiofilm formation in a time-dependent and concentration-dependent manner.ConclusionPseudomonasaeruginosalipopolysaccharide could modulateCandidaalbicansbiofilm formation by inhibit the hyphal development.

Pseudomonasaeruginosa；lipopolysaccharide；Candidaalbicans；biofilm

邓娟，女 (汉族)，硕士，住院医师.E-mail:dsy6241999@163.com

苏建荣,E-mail:yysujianrong@163.com

R 379.4

A

1673-3827(2016)11-0337-04

2016-09-18