荧光染色法和KOH湿片法在诊断浅部真菌感染中的效果比较

陈锐君 佟韬 李超 吴贤 陈琼 陈晓男 徐明 陈柏叡

(福州市皮肤病防治院，福州 350001)

荧光染色法和KOH湿片法在诊断浅部真菌感染中的效果比较

陈锐君 佟韬 李超 吴贤 陈琼 陈晓男 徐明 陈柏叡

(福州市皮肤病防治院，福州 350001)

目的 探讨荧光染色法在浅部真菌镜检中的应用价值。方法 收集100例皮肤科门诊疑似真菌感染的患者标本，分别运用荧光染色法和KOH湿片法对这些标本进行检测，并对检测结果进行比较。结果 荧光染色法共检出56例真菌阳性，而KOH湿片法只有39例阳性。荧光染色法的阳性检出率明显高于KOH湿片法 (χ2=5.79，P<0.05)。结论 荧光染色法是一种快速、准确的真菌检测方法，值得在皮肤科对真菌感染早期诊断的推广使用。

荧光染色法；KOH湿片法；真菌感染

[Chin J Mycol，2016，11(6):378-380]

浅部皮肤真菌病是最常发生于人类的真菌感染，主要由真菌侵犯表皮、毛发和甲引起的传染性皮肤病，它包括头癣、手足癣、体股癣、甲真菌病和花斑癣等。浅部皮肤真菌病传染性极强，且病情顽固，易传播和交叉感染，为人类健康带来严重危害[1]。临床用于真菌检测的方法包括直接涂片镜检、分离培养、免疫学检查等。目前KOH湿片法由于其操作简单、检测时间短等优点，仍是早期快速诊断真菌的常用检测方法。但因其敏感性低以及存在主观误差，临床上漏诊率较高。本院引进的真菌荧光染色法，可针对各种疑似真菌感染的标本进行检测，该法通过特殊的荧光素与真菌细胞壁的几丁质和纤维素相结合，在荧光显微镜下可见真菌清晰的轮廓，便于观察。本实验通过使用立特晰-真菌荧光染色液 (一步法)对临床疑似真菌感染的标本进行检测，并与KOH湿片法进行对比，探讨荧光染色法在诊断浅部真菌中的优势。

1 材料与方法

1.1 标本来源

取自2016年6月9～14日期间本院皮肤科门诊拟诊为浅部真菌感染者，共100例。取材部位包括：手足部34例，甲部16例，体股部43例，头面部7例。

1.2 材料

立特晰-真菌荧光染色液 (一步法)：由安徽德莱康生物医疗科技有限公司提供，试剂主要组分包括10%KOH、荧光素和复染剂；10%KOH溶液：称取10 g KOH溶于100 mL纯水中；20%KOH溶液：称取20 g KOH溶于100 mL纯水中；奥林巴斯CX31普通光学显微镜，莱卡荧光显微镜。

1.3 方法

分组 将同一患者取出的标本随机分为两份，一份用于KOH湿片法检测，另一份用于荧光染色法检测。

取材 用75%酒精在皮损处消毒，取活动性边缘的皮屑，指 (趾)甲取病甲内侧或者近端甲屑，头癣取病发及其周围鳞屑，酒精消毒后迅速取材，同时采集2份标本放置在2张载玻片上送检。

荧光染色法 直接向样本滴加1滴染色液，染色液以覆盖或淹没整个样本为准，停滞数秒。盖上盖玻片，使用棉签或纸巾压片，吸去多余染液。荧光显微镜下观察、拍图。

KOH湿片法 向载玻片上滴加1滴10%KOH溶液，盖上盖玻片后，酒精灯火焰上方微加热使标本溶解后，普通光学显微镜下观察、拍图。如为毛发或者指 (趾)甲，采用20%KOH溶液。

1.4 统计学处理

两种方法的检验结果采用χ2检验分析，P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

荧光染色后，真菌 (菌丝和孢子)被标记荧光，在镜下可见清晰的亮蓝色真菌轮廓，菌丝典型的横隔结构和孢子的出芽形态也能被呈现出来，易于识别。在荧光显微镜下，背景及杂质为暗黑色，真菌荧光与背景形成强烈反差 (见图1)。而KOH湿片法背景杂乱，真菌与背景反差小，真菌结构不易分辨和判断 (见图2)。

图1 荧光染色法各部位标本真菌染色效果 (×400)：a.手足部真菌，b.体股部真菌，c.头面部真菌，d.甲部真菌 图2 KOH湿片法各部位标本真菌染色效果 (×400)：a.手足部真菌，b.体股部真菌，c.头面部真菌，d.甲部真菌

Fig.1 The fluorescent staining effect of fungi in specimensfrom different parts of body (×400):a.Fungi of the hand and foot,b.Fungi of the body and thigh,c.Fungi of the head and face,d.Fungi of the nail Fig.2 The staining effect of fungi specimes from different parts of body in KOH wet method (×400):a.Fungi of the hand and foot,b.Fungi of the body and thigh,c.Fungi of the head and face,d.Fungi of the nail

统计结果表明，100例临床可疑诊断患者中，荧光染色法共检出56例阳性标本，其中手足部11例，体股部24例，头面部9例，甲12例。而KOH湿片法共检出39例阳性标本，其中手足部6例，体股部18例，头面部4例，甲11例 (见表1)。荧光染色法总阳性检出率明显高于KOH湿片法 (χ2=5.79,P<0.05)。而且从不同部位标本的结果对比也发现，荧光染色法阳性率均高于KOH湿片法 (见图3)。

与KOH湿片法相比，荧光染色法的总阳性检出率显著提高，差异有统计学意义。χ2=5.79,P<0.05。

表1 两种方法在不同部位标本真菌镜检结果比较

Tab.1 Comparison of two methods for fungal microscopic examination in specimens from different parts of body

部位荧光染色法KOH湿片法例数阳性阴性例数阳性阴性手足33112233627体股372413371819头面13941349甲部1712517116总计10056441003961

图3 两种方法在不同部位标本的阳性检出例数对比

Fig.3 Positive numbers of cases with two methods in detecting specimens from different parts of body

3 讨 论

临床上KOH湿片法是直接镜检使用最早的方法，该法操作简单、快捷，技术容易掌握，不需要特殊仪器。但缺点明显，例如背景杂乱、检出率偏低，甲屑标本尤为明显，且孢子类结构易与气泡、脂滴混淆，容易造成错诊。荧光染色法通过特殊荧光素与真菌细胞壁中的几丁质发生特异性结合[2]，而且亲和力高，反应时间只需数十秒钟即可完，大大提高临床真菌检测灵敏度和效率。在荧光显微镜特定的激发光波段下 (340～400 nm)，菌丝或孢子发出明亮的蓝绿色荧光，真菌轮廓和黑暗背景可形成强烈对比反差，真菌形态结构较KOH湿片法更为清晰，非常便于找寻和识别。而且真菌荧光染色液也含10%KOH，溶解角质，使组织透化。值得注意的是，荧光染色法也能标记植物纤维素，空气和玻片上存在的少量纤维，在荧光显微镜下发荧光。但纤维形态一般不规则，大小、粗细、亮度等都与真菌有很大差异，没有典型的真菌横隔和出芽结构，凭经验一般可以避免假阳性情况的发生。

本实验所使用的试剂立特晰-真菌荧光染色液 (一步法)为单剂型染色液，不仅在操作上与KOH法步骤一致，只需数十秒即可镜下观测 (甲屑需延长1～2 min)。而且标本中菌丝、孢子荧光标记后结构清晰，显著提高了菌体辨识度。已经有大量文献证明荧光染色法能提高真菌检测阳性率[3-6]。本实验通过收集我院皮肤科门诊疑似浅部真菌感染患者的标本，将荧光染色法与KOH湿片法对比，也发现荧光染色法在诊断浅部真菌感染中显著提高真菌检出阳性率。在具备荧光显微镜的条件下，荧光染色法可取代传统的KOH湿片法，成为常规真菌镜检的一种优良检测方法。

[1] 许超，谢光洪，曹永国，等.真菌性皮肤病检测方法研究进展[J].动物医学进展，2008,29(S1)：27-29.

[2] 张宏，吴绍熙.深部真菌病快速诊断的新实验方法[J].国外医学皮肤性病学分册，1995,21(1)：12-14.

[3] 杨通，何炼图，陈涛，等.荧光染色剂Calcofluor white在活检组织中真菌染色的应用[J].分子诊断与治疗杂志，2014，6(2)：307-311.

[4] 张伟宏，王丽娅，韩雷，等.KOH湿片镜检法与CFW荧光染色法诊断真菌性膜炎的效果比较[J].郑州大学学报(医学版)，2010，45(2)：193-195.

[5] Honig PJ，Sullivan K，McGowan KL.The rapid diagnosis of tinea capitis using calcofluor white[J].Pediatr Emerg Care，1996,12(5):333-335.

[6] Ramos L，Mellado S，Ramadan S，et al.The use of calcofluor white for studying Malassezia species by direct microscopy[J].Rev Argent Microbiol，2006,38(1)：4-8.

[本文编辑] 王 飞

·真菌病治疗·

Comparison of fluorescent staining method and KOH wet method for diagnosis of superficial fungal infections

CHEN Rui-jun，TONG Tao，LI Chao，WU Xian，CHEN Qiong，CHEN Xiao-nan，XU Ming，CHEN Bo-rui

(FuzhouDermatosisPreventionHospital,Fuzhou350001)

Objective To explore the application value of fluorescent staining method for superficial fungal microscopic examination.Methods One hundred cases with suspected fungal infection were collected in the department of dermatology.Fluorescent staining method and KOH wet method were used respectively to detect these samples,and the results were compared.Results A total of 56 cases of fungal positive were detected with fluorescent staining method,while there were only 39 cases of fungal positive with KOH wet method.The positive detection rate of fluorescent staining method was higher than that of KOH wet method (χ2=5.79，P<0.05).Conclusion The fluorescent staining method is a rapid and accurate method to detect fungi.It is worth to be used in the department of dermatology for the early diagnosis of fungal infection.

fluorescent staining method;KOH wet method;fungal infection

福州市科技计划项目 (2013-S-128-4)

陈锐君，女 (汉族)，本科，初级检验技师.E-mail:mone882003@qq.com

徐明,E-mail:15359725945@163.com

R 446.5

A

1673-3827(2016)11-0378-03

2016-08-03