白念珠菌HSP90与人源HSP90的克隆表达及其C端的比较分析

孟靖顺 吴建华 赵静 王玉莲 薛伟

(1.上海长海医院，上海 200433；2.中国科学院大学，上海 200031)

·论著·

白念珠菌HSP90与人源HSP90的克隆表达及其C端的比较分析

孟靖顺1吴建华1赵静1王玉莲1薛伟2

(1.上海长海医院，上海 200433；2.中国科学院大学，上海 200031)

目的 分别体外表达纯化白念珠菌HSP90 (CaHSP90)和人源HSP90 (hHSP90)并分析C-端序列差异对其体外状态下分子聚合度的影响。方法 我们将CaHSP90、hHSP90野生型及其C-端酶切碱基序列通过PCR进行扩增并通过NdeI/XhoI酶切位点连接到到pET22b+质粒中。将构建好的上述质粒转入大肠杆菌E.coliBL21 (DE3)中进行表达并通过Ni2+-NTA柱以及Superdex-200快速柱层析系统 (FPLC)纯化。所得蛋白通过SDS-PAGE以及分子排阻色谱 (SEC)测定分子量和聚合状态。结果 通过测序鉴定所有质粒构建成功，并最终纯化得到足够纯度的蛋白进行SEC分析实验。分析结果表明野生型CaHSP90和hHSP90在体外具有相似的聚合度，而C-端突变后则存在明显差异。结论 CaHSP90和hHSP90的C-端结构域对其体外聚合状态有着不同的影响，CaHSP90的C-端结构域有可能成为CaHSP90抑制剂一个潜在靶点。

白念珠菌；HSP90；蛋白结构；蛋白表达与纯化

[Chin J Mycol，2016，11(6):321-326]

白念珠菌是一种条件致病菌，近年来随着抗菌药物的滥用，白念珠菌的致病率逐年上升。由于白念珠菌对药物的耐受性越来越强，我们对于白念珠菌的抗药性研究也不断深入。研究发现白念珠菌的HSP90在白念珠菌的致病以及耐药机制中有重要作用[1]。

HSP90参与了白念珠菌的生长和耐药等多条通路[2]，HSP90参与的白念珠菌耐药的主要通路包括了MCK1通路和蛋白磷酸酶 (Calcineurin)通路[3]。研究发现HSP90的敲除会使白念珠菌的耐药性大大降低[4]，HSP90在白念珠菌体内主要通过折叠转运部分重要的耐药因子起作用[5]。白念珠菌体内存在了大量HSP90的客户蛋白[6]，它们包括耐药蛋白和转录因子，在高盐、高温、pH、药物作用等不同的环境和条件下，HSP90在白念珠菌体内会参与不同的耐药机制与不同的客户蛋白相结合[7]。

如何阻断和影响HSP90与白念珠菌耐药因子的结合是降低白念珠菌耐药性的一种新途径。研究发现HSP90C端在HSP90的辅助功能中起到重要作用，C端的结构变化会直接影响HSP90的二聚体形成从而抑制HSP90与客户蛋白的结合[8]。我们通过质粒构建，蛋白的表达，镍柱纯化，Superdex蛋白分析等技术手段对白念珠菌HSP90在体外进行了研究，发现在体外，白念珠菌HSP90C端部分缺失后白念珠菌HSP90的二聚结构明显改变，而人体HSP90的二聚结构没有明显的变化，人体HSP90C端部分切除后接近于二聚形态的存在。中科院已有研究证明HSP90在体外多聚形态的发生与其蛋白性质有关，跟它本身二聚结构变化没有明显关系[9]，多聚体的形成主要是C端的改变以及温度等变化引起，这为进一步了解了白念珠菌HSP90的结构并为以后开展白念珠菌HSP90的体外研究提供了技术支持。

1 材 料

1.1 菌株和质粒

本次研究所使用的BL21大肠杆菌菌株主要购自上海士锋有限公司，TOP10感受态细胞由上海中科院生命科学院提供。SC5314菌株基因库由中科院生命科学院真菌实验组提供。pET22b质粒和人体HSP90cDNA由上海中科院生命科学院提供。

1.2 培养基

LB液体培养基：0.5%酵母提取物 (YEAST EXTRACT，英国Oxoid公司)+1%蛋白胨 (TRYPTONE，同上)+1%NaCl (国药集团化学试剂有限公司)，121℃高压灭菌；含氨苄青霉素 (Ampicillin，上海生工生物有限公司)的LB固体培养基：0.5%酵母提取物 (YEAST EXTRACT，英国Oxoid公司)+1%蛋白胨 (TRYPTONE，同上)+1%NaCl (同上)+1.5%琼脂粉 (国药集团化学试剂有限公司)，121℃高压灭菌，倒板。

1.3 主要试剂盒仪器

Taq酶 (购自Takara公司)；KOD酶 (购自TOYOBO公司)；DNAmark (天根)；限制性内切酶NDEΙ、XhoΙ (购自Fernenters公司)；连接酶ligase酶 (购自TOYOBO)；胶回收试剂盒 (购自Waston公司)；Ni-NTAagarose (购自德国Qiagen公司)；PCR仪 (Verite公司，美国)；紫外分光光度计岛津UV-2100 (购自岛津公司)；紫外线扫描仪 (Alpha Innotech公司)；蛋白胶扫描仪 (GE公司)；蛋白水平电泳仪 (BIO-RAP公司)；高速冷冻离心机ThermoR6+ (Thermo Fish公司)；凝胶过滤层析柱superdex200和仪器AKTK-FPLC (购自GE公司)。

1.4 引物

CaHSP90，hHSP90的碱基序列全长分别为2 121 bp和2 172 bp。我们用multalin软件处理后选择了相应的酶切位点主要包括Nde1和Xho1。我们根据pET22b质粒酶切位点，设计了CaHSP90，CaHSP90 (1-673)，CaHSP90 (1-655)，hHSP90，hHSP90 (1-696)，hHSP90 (1-679)等质粒，并根据primer软件设计了相关的引物。引物合成主要有上海生工生物有限公司合成。

2 方 法

2.1 实验设计

通过计算机软件multalin对白念珠菌HSP90和人体HSP90的对比分析发现人体HSP90和白念珠菌HSP90的同源性接近65%，尤其是N端和M区域蛋白氨基酸序列同源性较高，只有二者的C端和最短的linker区域差异性最大。通过对相关文献的以及软件分析得出白念珠菌HSP90C端氨基酸序列655-707对应于人体的HSP90的679-723，这段C端氨基酸序列在HSP90的结构以及功能中起到关键的作用，所以我们构建了人源HSP90与白念珠菌HSP90的C端缺失质粒 (见表1)，然后用体外研究的方式来发现两者的差异。

2.2 质粒的构建与转化

设计引物 (见表2)后用KOD体系进行PCR以白念珠菌HSP90和人体HSP90以及相关目的基因为模板片段扩增。KOD体系：1 μL KODpuls，0.5 μL Template，1.5 μL Primer F，1.5 μL Primer R，5 μL 10×KOD buffer，5 μL dNTP，2μL MgSO4，33.5 μL ddH2O，总体系50 μL。PCR反应体系：95℃ 5 min预变性；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，共30个循环，72℃ 10 min进行充分延伸。PCR完成后PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳40 min 110 V，用DNA试剂盒胶回收。酶切，将胶回收产物进行酶切，酶切体系为：20 μL回收产物，3 μL 10×bufferH，1 μL Nde1，1 μL Xho1，5 μL ddH2O，总体系30 μL，酶切反应条件：水浴3 h，37℃；连接，在酶切结束后用质粒抽提试剂盒对酶切产物进行洗涤，12 μL 2×ligase，10 μL质粒pET22b，12 μL酶切产物，连接条件：室温，2 h；转化，将17 μL连接产物加入70 μL TOP10感受态细胞中，转化条件：冰浴30 min ，42℃热激90 s，涂LB培养板，37℃过夜；挑单克隆，在事先准备好的5 mL LB小管中加入5 μL氨苄青霉素，用枪头将平板上的菌落挑入5 mL培养基小管，条件：37℃，200 r/min，6 h。菌液PCR进行鉴定，反应体系：2×Taq酶12.5 μL，Primer F 1 μL，Primer R 1 μL，ddH2O 9.5 μL，总体系25 μL，取200 μL菌液到上海生工生物有限公司测序，将有目的条带的剩余菌液用质粒抽提试剂盒进行质粒抽提。

表1 菌株和质粒

表2 实验涉及的引物序列

2.3 蛋白的表达与纯化

将测序完的目的质粒转入BL21感受态细胞，1 μL目的质粒加入70 μL BL21感受态细胞中冰浴30 min，42℃热激90 s，涂板，37℃过夜，挑单克隆抗体，将菌落挑至5 mL含氨苄青霉素培养基中，200 r/min，8 h后接入1 L含氨苄青霉素的培养基中，200 r/min，3 h加1 mL IPTG诱导剂，168 r/min，23℃，11 h。6 000 r/min，6 min离心收菌，用40 mL Thrombin buffer稀释沉淀，破菌15 min，Thrombin buffer 1 L配制：25 mmol/L Tris 6.06 g，150 mmol/L NaCl 8.77 g，pH 8.0，破菌后用15 000 r/min高速离心15 min，取上清，上6×His 5 mL镍柱，因为pET22b质粒C端带有his-tag标签，所以利用重力原理的方法目的蛋白会与镍柱填料特异性结合。纯化流程：用20 mLThrombin buffer平衡镍柱，流速为2 mL/min，取20 mL上清上样，流速为0.6 mL/min；取20 mL Thrombin buffer上柱将杂蛋白快速洗脱；用20 mL Ni-NTA elution buffer上柱，将目的蛋白洗脱，流速为0.6 mL/min。Ni-NTA elution buffer 1 L配制：50 mmol/L Na2HPO4·2H2O 7.8 g，500 mmol/L NaCl 29.22 g，250 mol/L Imidazole 17.02 g，pH 8.0。分别取诱导前，诱导后，破碎后上清，Thrombin buffer洗脱液，Ni-NTA elution buffer洗脱液40 μL加入40 μL 2×蛋白上样缓冲液，100℃煮样，5 min，配制12%蛋白胶体，上样进行蛋白电泳200 V，50 min，考马斯亮染色。

2.4 蛋白质结构分析

将纯化后蛋白用10 kD超滤离心管浓缩，5 400 r/min，15 min。将浓缩后蛋白样品进行离心，取3 mL样品进行上样，用制备柱Superdex200进行NMRbuffer置换以及近一步纯化。1 L NMR配制：13.7 mmol/L NaH2PO4·12H2O 2.14 g，6.3 mmol/L 3Na2HPO4·2H2O 2.26 g，50 mmol/L NaCl 2.92 g，pH 8.0。AKTK-FPLC接上buffer后，进行柱体积平衡，流速设为0.6 mL/min，柱体积为130 mL。将收集后的蛋白进行再次浓缩并用紫外线分光光度计进行浓度测定，将分光光度计波长调至280 nm，测定体积为100 μL。将浓度统一稀释到50 μmol/L，上样前用标准物质过柱测出分析柱标准计算公式，再用NMRbuffer平衡分析柱，样品离心后上Superdex200分析柱蛋白分析，分析柱流速设为0.3，体积为30 mL。过柱时将收到的主峰蛋白进行SDS-PAGE，再用考马斯亮蓝染色。

3 结 果

3.1 CaHSP90，hHSP90以及相关质粒载体的构建

CaHSP90以及C端部分切除的质粒通过PCR进行扩增PCR结果见图1。菌液PCR鉴定CaHSP90、CaHSP90 (1-673)、CaHSP90 (1-655)，我们发现这些蛋白都进行了正常的质粒复制 (见图2)。人体的HSP90琼脂糖凝胶电泳结果 (见图3)，通过上海生工生物有限公司质粒测序发现HSP90没有位点发生突变，包括C端部分切除的HSP90。

3.2 CaHSP90，hHSP90以及它们C端部分切除后的蛋白电泳结果

在构建了CaHSP90、CaHSP90 (1-673)、CaHSP90 (1-655)、hHSP90、hHSP90 (1-679)、hHSP90 (1-696)等质粒后，通过复制转入大肠杆菌BL21感受态细胞进行表达纯化。我们发现白念珠菌HSP90以及C部分切除后白念珠菌HSP90在大肠杆菌中能够大量表达和纯化，在pET22b质粒C端具有6×his-tag标签通过与his-镍柱特异性结合得到目的蛋白再进行SDS-PAGE，见图4，HSP90分子质量为82 kD。图5为人体HSP90以及C端部分切除后的蛋白纯化结果，hHSP90为88 kD。

3.3 用凝胶过滤层析柱进行蛋白分析

将白念珠菌HSP90以及白念珠菌HSP90C端部分切除后的蛋白进行浓缩，然后用凝胶过滤层析柱superdex200进行蛋白质分析，我们采用同样的方法对人体的HSP90以及人体HSP90C端部分切除的蛋白进行分析，最后进行比较。本次实验主要测试浓度为50 μmol，上样量统一为100 μL，过superdex200进行分析，结果见图6，将出峰体积代入标准公式计算分子质量，我们发现白念珠菌HSP90 (1-655)分子质量为114.3 kD，单体为77 kD，介于单体和二体之间，而相对应的人体HSP90 (1-679)为176.5 kD,单体为78 kD，所以为二体。本文中CaHSP90全长、hHSP90全长和CaHSP90 (1-673)三个都形成了多聚体。通过该实验我们发现白念珠菌HSP90在C端655至末端部分切除后会影响其二聚状态，使其由二聚向单体过渡，这从理论上破坏了白念珠菌HSP90的二聚体结构，二聚体结构的破坏将影响HSP90的辅助功能。关于人源HSP90，我们主要设计了3个实验，见图7～9。图7～9中3条线分别代表3个蛋白浓度梯度，本次实验我们主要是研究50 μmol这条梯度的蛋白样品，结构显示：hHSP90的出峰体积10.47 mL,分子质量268 kD，为多聚体 (见图7)；hHSP90 (1-679)的出峰体积11.53 mL,分子质量176.5 kD，为二聚体 (见图8)；hHSP90 (1-696)，出峰体积8.62 mL，分子质量588 kD，为多聚体 (见图9)。我们推断人hHSP90c和CaHSP90C端部分序列对于HSP90二聚体的形成有较大差异。为了证明白念珠菌HSP90未出现明显降解，我们将过superdex200分析的蛋白样品重新收集，进行蛋白电泳，见图10。

4 讨 论

目前而言有关白念珠菌的分子生物学发展较快，但部分领域仍然不足。本次实验中我们通过计算机软件分析了人源HSP90与白念珠菌HSP90的蛋白氨基酸序列的差异 (见图11)。

在后续的体外实验中，首先我们通过pET22b质粒构建了CaHSP90、CaHSP90 (1-673)和CaHSP90 (1-655)，并通过PCR和菌液PCR成功扩增鉴定了目的序列。这套方法对于构建白念珠菌相关基因载体以及部分基因缺失的载体有指导作用，对以后研究白念珠菌的部分基因序列提供了一定的技术支持。

其次我们运用了His-镍柱的蛋白纯化技术对白念珠菌HSP90以及部分C端切除后的HSP90蛋白进行纯化，我们发现CaHSP90、CaHSP90 (1-673)、CaHSP90 (1-655)能够在体外表达纯化并能够得到特异性较高的目的蛋白，这为以后进行白念珠菌关键蛋白体外实验功能的研究奠定了基础。

图1 白念珠菌HSP90 PCR电泳图全长，CaHSP90 (1-673)，CaHSP90 (1-655)电泳图，全长分别为2 121 bp、2 019 bp、1 965 bp 图2 CaHSP90 (1-673)，CaHSP90 (1-655)，CaHSP90在Top10感受态细胞中克隆表达后电泳图 图3 hHSP90 (1-679)，hHSP90 (1-696)和hHSP90的电泳结果图 图4 白念珠菌HSP90，白念珠菌HSP90 (1-673)，白念珠菌HSP90 (1-655)的蛋白his-镍柱纯化后蛋白电泳图 图5 人体HSP90、人体HSP90 (1-696)、人体HSP90 (1-679)的his-镍柱纯化后蛋白电泳图 图6 黑线条：白念珠菌HSP90，出峰体积10.57 mL，分子质量247.3 kD；红色线条：CaHSP90 (1-673)，出峰体积10.76 mL，分子质量239.4 kD；蓝色线条：CaHSP90 (1-655)，出峰体积12.63 mL，分子质量114.3 kD 图7 人体HSP90，出峰体积10.47 mL，分子质量268.5 kD 图8 人体HSP90 (1-679)，出峰体积11.53 mL，分子质量176.5 kD 图9 人体HSP90 (1-696)，出峰体积8.62 mL，分子质量588 kD

注：图6～9分子质量由标准公式Y=-0.727 7X+3.076 3，R2=0.999 8，y=logMW计算得出 (公式校准条件：Eluent 20 mmol/L PBS，50 mmol/L NaCl，pH 6.5，Sample Volume=0.5,Flow rate=0.5 mL/min，room template)

Fig.1 The electrophoresis results of CaHSP90,CaHSP90 (1-673) and CaHSP90 (1-655) Fig.2 The electrophoresis results of CaHSP90 (1-673)，CaHSP90 (1-655) and CaHSP90 pET22b in the Top10 Fig.3 The electrophoresis results of hHSP90 (1-679),hHSP90 (1-696) and hHSP90 Fig.4 The purified proteins electrophoresis results of CaHSP90，CaHSP90 (1-673)，CaHSP90 (1-655) Fig.5 The His-tag purified proteins electrophoresis results of hHSP90，hHSP90 (1-673)，hHSP90 (1-655) Fig.6 Black line：CaHSP90,peak volume 10.57 mL,molecular weight 247.3 kD;Red line:CaHSP90 (1-673),peak volume 10.76 mL,molecular weight 239.4 kD;Blue line:CaHSP90 (1-655),peak volume 12.63 mL,molecular weight 114.3 kD Fig.7 hHSP90,peak volume 8.26 mL,molecular weight 268.5 kD Fig.8 hHSP90,peak volume 11.53 mL,molecular weight 176.5 kD Fig.9 hHSP90,peak volume 8.62 mL,molecular weight 588 kD The standard formula Y=-0.727 7X+3.076 3,R2=0.999 8,y=logMW (formula calibration condiion：Eluent 20 mmol/L PBS，50 mmol/L NaCl，pH 6.5，Sample Volume=0.5,Flow rate=0.5 mL/min，room template)

最后我们通过蛋白纯化技术以及凝胶过滤层析柱superdex200技术进行蛋白分析，发现白念珠菌HSP90C端氨基酸序列 (655-707，即655至末端)与人体HSP90C端氨基酸序列对应部分 (679-723,即679至末端)具有较大的差异，白念珠菌HSP90 (1-655)是介于单体和二体之间，证实了氨基酸序列 (655-707)的切除对于白念珠菌HSP90的二聚结构产生较大影响，我们通过文献了解HSP90辅助功能的作用机制与其二聚结构密不可分，改变白念珠菌HSP90 的二聚形态可能会影响它与部分关键耐药因子的结合，本次实验发现人体HSP90氨基酸序列 (679-723)的切除对其二聚体结构并未形成明显改变。

图10 白念珠菌HSP90过superdex200后的蛋白电泳图 图11 蛋白分析结果图

近年来研究得出人体HSP90与白念珠菌HSP90同源性高达近65%，所以无论是HSP90N端抑制剂还是部分C端抑制剂在治疗白念珠菌的同时对人体HSP90也同样产生抑制作用引起较大的副作用[9]。本次研究发现白念珠菌HSP90与人体HSP90的结构差存在异，HSP90二聚结构对于HSP90与客户蛋白结合有密切联系[10-11]，所以通过结构差异分析对于未来研究白念珠菌HSP90特异性的抑制剂具有重要的意义。

[1] Cowen LE.The fungal Achilles' heel:targeting Hsp90 to cripple fungal pathogens[J].Curr Opin Microbiol,2013,16(4):377-384.

[2] LaFayette SL,Colins C,Zaas AK,et al.PKC signaling regulates drug resistance of the fungal pathogenCandidaalbicansvia circuitry comprised of Mkc1,calcineurin,and Hsp90[J].PLoS Pathog,2010,6(8): e1001069.

[3] Leach MD,Budge S,Walker L,et al.Hsp90 orchestrates transcriptional regulation by Hsf1 and cell wall remodelling by MAPK signalling during thermal adaptation in a pathogenic yeast[J].PLoS Pathog,2012,8(12):pe1003069.

[4] Veri A,Cowen LE.Progress and prospects for targeting Hsp90 to treatfungal infections[J].Parasitology,2014,141(9):1127-1137.

[5] Singh SD,Robbins N,Zaas AK,et al.Hsp90 governs echinocandin resistance in the pathogenic yeastCandidaalbicansvia calcineurin[J].PLoS Pathog,2009,5(7):e1000532.

[6] Khurana N,Bhattacharyya S.Hsp90,the concertmaster:tuning transcription[J].Front Oncol,2015,5:100.

[7] Zhao R,Davey M,Kaplanek P,et al.Navigating the chaperone network:an integrative map of physical and genetic interactions mediated by the hsp90 chaperone[J].Cell,2005,120(5):715-727.

[8] Ciqlia E,Verqin J,Reimann S,et al.Resolving hot spots in the C-terminal dimerization domain that determine the stability of the molecular chaperone Hsp90[J].PLoS One,2014,9(4):e96031.

[9] Nemoto T,Sato N.Oligomeric forms of the 90-kDa heat shock protein[J].Biochem J,1998,330 ( Pt 2):989-995.

[10] Zhao H,Garg G,Zhao J,et al.Design,synthesis and biological evaluation of biphenylamide derivatives as Hsp90 C-terminal inhibitors[J].Eur J Med Chem,2015,89:442-466.

[11] Graf C,Lee CT,Eva Meier-Andrejszki L,et al.Differences in conformational dynamics within the Hsp90 chaperone family reveal mechanistic insights[J].Front Mol Biosci,2014,1.DOI:10.3389/fmolb.2014.00004.

[本文编辑] 卫凤莲

Purification and C-terminal domain comparison of heat shock protein 90 (HSP90) inCandidaalbicansand human

MENG Jing-shun1，WU Jian-hua1，ZHAO Jing1，WANG Yu-lian1，XUE Wei2

(1.Changhaihospital，Shanghai200433，China；2.UniversityofChineseAcademyofSciences，Shanghai200031，China)

Objective To express and purifyCandidaalbicansHSP90 (CaHSP90) and human HSP90 (hHSP90) and to compare the different effects of C-terminal domain on their oligomeric formsinvitro.Method The encoding sequences for wild type CaHSP90,hHSP90 and their C-terminal enzyme digested base sequences were amplified via PCR and the products were cloned into pET-22b+vector using NdeI/XhoI cloning sites.The plasmids were expressed inE.coliBL21 (DE3) cells and the His-tagged proteins were purified through Ni2+-NTA column and Superdex-200 column chromatography on FPLC.The molecular weights and oligomeric forms of these proteins were analyzed by SDS-PAGE and size exclusion chromatography (SEC).Results All plasmids were successfully constructed by DNA sequencing and the proteins were pure enough for SEC analysis.The results showed that wild type CaHSP90 and hHSP90 have similar oligomeric forms,while their C-terminal mutants were different.Conclusions The C-terminal domain of CaHSP90 and hHSP90 have different effect on their oligomeric formsinvitroand might be a potential target for CaHSP90 inhibitor.

Candidaalbicans;HSP90;protein structure;protein expression and purification

973子课题 (2013CB531602)

孟靖顺，男 (汉族)，硕士研究生在读.E-mail:1781069890@qq.com

吴建华,E-mail:wujh_cn@163.com

R 379.4

A

1673-3827(2016)11-0321-06

2016-09-28