动态浊度法检测冻干甲型肝炎减毒活疫苗细菌内毒素含量的研究

曾艳，孙阳，蓝燕，崔越，董历子，杨红育

(长春生物制品研究所有限责任公司，吉林长春130062)

动态浊度法检测冻干甲型肝炎减毒活疫苗细菌内毒素含量的研究

曾艳，孙阳，蓝燕，崔越，董历子，杨红育*

(长春生物制品研究所有限责任公司，吉林长春130062)

探讨动态浊度法检测冻干甲型肝炎减毒活疫苗细菌内毒素含量的可行性。参照《中国药典》2015年版通则1143细菌内毒素检测法中动态浊度法，对甲肝疫苗进行标准曲线可靠性试验、干扰初筛试验、干扰验证试验及内毒素含量的测定，同时与经凝胶法检定合格的同批疫苗进行比较。标准曲线可靠性试验结果符合规定。干扰初筛试验疫苗稀释160、320及640倍，回收率在50%～200%之间，均无干扰，符合要求。干扰验证试验结果进一步表明:疫苗稀释160倍对试验无干扰作用。采用动态浊度法检测的10批甲肝疫苗细菌内毒素含量均小于该疫苗的限值L=20 EU/mL，且与经凝胶法检定的同批疫苗结果一致。采用动态浊度法检测甲肝疫苗细菌内毒素含量是可行的，值得推广应用。

动态浊度法;细菌内毒素;冻干甲型肝炎减毒活疫苗

生物制品、药品检查热原或细菌内毒素(内毒素是热原的一种，在GMP条件下控制内毒素污染就是控制热原污染)是保证制品质量，使用安全的重要的检验项目之一。家兔热原检查法(Rabbitpyrogen test，RPT)是世界许多国家药典规定的检查热原的法定方法［1-3］，曾对保证制品质量、使用安全发挥了重要作用，但是，家兔热原检查法不能定量反应热原的含量，不易标准化，结果重复性较差，不适于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂，且受动物来源品种健康状况、个体差异等影响较大［4-5］。细菌内毒素检查法(bacterial endotoxins test，BET)因其简便、灵敏、快速、准确等优点，现已逐步代替传统的RPT检查热原［6-8］。细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度测定法，后者包括动态浊度法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度或透光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。现已被广泛用于医药工业、药品检验、临床检查、环境保护、食品工业甚至电子工业等的致热物质的检查［9-10］，但在生物制品方面的应用报道较少。为了探讨动态浊度法检测冻干甲型肝炎减毒活疫苗(简称甲肝疫苗)细菌内毒素含量的可行性，本研究采用动态浊度法对甲肝疫苗进行了细菌内毒素含量的检测，并与经凝胶法检定合格的同批疫苗进行比较。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 甲肝疫苗长春生物制品研究所有限责任公司产品，均经凝胶法检定合格的成品。批号20140307、20140408、20140409、20140412、20140413、20140515、20140517、20140518、20140519、20140621、20140622、20140723、20140724、20140725、20140726、20140727。

1.1.2 试剂①动态浊度法鲎试剂:湛江安度斯生物有限公司产品，批号1106162，规格10～0.03 EU/mL;②细菌内毒素检查用水(简称BET用水):湛江安度斯生物有限公司产品，批号1107230，内毒素含量＜0.003 EU/mL;③细菌内毒素工作标准品:中国食品药品检定研究院，批号150601-201072，规格120 EU/支。

1.1.3 仪器及设备ATi321-06型动态试管检测仪，英国莱伯金耐特有限公司产品;试验中所有接触被检品的用具均经除热原处理。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线可靠性试验①方法:取细菌内毒素工作标准品，用BET水稀释，使其最终浓度为2.00、0.25、0.031 25 EU/mL的稀释系列溶液，各取0.1 mL，分别置于预先加有0.1 mL鲎试剂的反应管内，混合均匀，插到动态试管检测仪上进行检测。同时以BET水做阴性对照，每个浓度平行做两管，反应结束后仪器自动显示出回归方程、相关系数、实测值。②结果判断:《中国药典》［3］要求，阴性对照的反应时间应大于标准曲线最低点的反应时间，标准曲线的相关系数(r)的绝对值应大于或等于0.980，厂家建议变异系数CV%小于10%，试验方为有效。

1.2.2 干扰初筛试验①甲肝疫苗限值的确定:按照长春生物制品研究所有限责任公司《冻干甲型肝炎减毒活疫苗检定标准操作规程》SOP 05-6-0-001的规定，甲型肝炎减毒活疫苗细菌内毒素限值L=20 EU/mL。②甲肝疫苗最大有效稀释倍数的确定:最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数(MVD)，按以下公式计算:MVD=CL/λ。式中C:供试品甲肝疫苗的浓度，当L以EU/mL表示时，C等于1.0 mL/mL;L:甲肝疫苗的限值，L=20 EU/mL;λ:动态浊度法中标准曲线最低点浓度(0.031 25 EU/ mL)，MVD=(20 EU/mL×1.0 mL/mL)/0.031 25 =640倍。③干扰初筛试验方法:取甲肝疫苗3批(20140307、20140408、20140409)，用BET水分别稀释至160、320、640倍作为样品液，同时以同样倍数稀释，但在稀释液中添加了近标准曲线中点浓度的内毒素标准品0.25 EU/mL作为样品回收液，以BET水配制的浓度为0.031 25、0.25及2.00 EU/mL内毒素标准品溶液作为标准曲线液，另外以BET水作为阴性对照，分别取上述各液(每个浓度平行做两管)0.1 mL，分别置于预先加有0.1 mL鲎试剂反应管中，混合均匀，插入到动态试管检测仪上进行检测。反应结束后仪器自动显示回归方程、相关系数、回收率、达限平均反应时间、变异系数、实测值。④结果判断:《中国药典》［3］要求，除符合标准曲线要求外，回收率应在50%～200%的范围内。在此试验条件下，供试品溶液对试验无干扰作用。

1.2.3 干扰验证试验干扰验证试验与干扰初筛试验的方法、反应项目及判断标准相同，不同点在于干扰初筛试验对几个浓度进行筛选，而干扰试验只做一个浓度确认。根据干扰初筛结果，本文确定甲肝疫苗干扰验证试验浓度为160倍。另取甲肝疫苗3批(20140412、20140413、20140415)，分别用BET水稀释至160倍，按干扰初筛试验方法进行干扰验证检测和判断。

1.2.4 动态浊度法定量检测与凝胶法检测结果对比选取10批(详见表5)甲肝疫苗，分别用BET水稀释160倍，按动态浊度法进行细菌内毒素含量的检测。同时与经凝胶法检定合格的同批疫苗进行比较。结果判断:若疫苗实测浓度(以EU/mL表示)，在标准曲线(2.0～0.031 25 EU/ mL)范围内，则以实测值乘以稀释倍数判定结果;若疫苗实测值浓度在标准曲线范围以外，则以标准曲线最低点浓度(如0.031 25 EU/mL)乘以稀释倍数判定结果。若检测出的细菌内毒素含量小于该疫苗的限制(L=20 EU/mL)判为合格，否则判为不合格。

2 结果与分析

2.1 标准曲线可靠性试验结果

用BET水将细菌内毒素工作标准品分别稀释成0.031 25、0.25、2.00 EU/mL，进行检测，结果见表1、2。

由表1可见，阴性对照的反应时间大于标准曲线内毒素的最低点反应时间，标准曲线相关系数(r)的绝对值大于0.980，变异系数(CV%)小于10%，试验有效。标准曲线符合《中国药典》［3］规定，成立。由表2可见，阴性对照的反应时间大于标准曲线内毒素的最低点反应时间，标准曲线的相关系数(r)绝对值大于0.980，变异系数(CV%)小于10%，试验有效。标准曲线符合《中国药典》［3］规定，成立。

表1 标准曲线可靠性试验结果Table 1Reliability test results of standard curve

表2 标准曲线可靠性试验结果Table 2Reliability test results of standard curve

2.2 干扰初筛试验

取甲肝疫苗3批，用BET水分别稀释至160、320及640倍。按上述干扰初筛试验方法进行检测，结果见表3。

表3 样品干扰初筛试验结果Table 3Results of interference initial screening test

续表3

由表3可见，标准曲线符合《中国药典》［3］规定，试验有效。3批样品的回收率在73.88%～139.48%之间，在50%～200%之间，符合药典的要求。结果表明甲肝疫苗在稀释160、320及640倍的条件下均无干扰作用。因为凝胶法检定细菌内毒素采用160倍稀释，所以本研究也选择160倍稀释液作为干扰验证试验浓度。

2.3 干扰验证试验

取3批甲肝疫苗，分别用BET水稀释160倍，按干扰筛选试验方法进行检测。结果见表4。

表4 样品干扰验证试验结果Table 4Results of interference verification test

由表4可见，3批疫苗的回收率分别为80.40%、139.76%、132.8%，均在50%～200%之间，符合药典的要求。回归方程LgTg= 2.922 4－0.256 2 LgC，相关系数(r)－0.997 2，标准曲线符合《中国药典》［3］规定，试验有效。试验进一步证明，甲肝疫苗160倍稀释时确无干扰作用，试验结果表明甲肝疫苗可用此法进行细菌内毒素检测。

2.4 浊度法定量检测与凝胶法检测结果对比

按浊度法检测的细菌内毒素含量，与经凝胶法检定的同批疫苗含量的对比，结果见表5。由表5可见浊度法检测的10批疫苗细菌内毒素含量均小于该疫苗的限值L=20 EU/mL，判定为合格，经凝胶法检出的细菌内毒素含量也均小于该疫苗的限值L=20 EU/mL，判为合格。两种方法检测结果一致。

表5 动态浊度法定量检测与凝胶法检测比较Table 5Comparison of the detection results of the turbidity method and the gel method

续表5

3 讨论

本研究采用英国ATi321-06型动态试管检测仪，按照《中国药典》［3］中动态浊度法对甲肝疫苗进行了干扰初筛试验。在疫苗稀释160、320及640倍的情况下，均无干扰作用，符合规定要求。干扰验证试验进一步证明，疫苗稀释160倍无干扰，可做日常检查的浓度，用于细菌内毒素含量的检测。

《中国药典》［3］规定，细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度法，后者包括动态浊度法，供试品检测时可使用其中任何一种方法进行试验，当结果有争议时，除另有规定外以凝胶法为准。本研究采用动态浊度法对10批甲肝疫苗细菌内毒素含量检测的结果，与凝胶法检定的同批疫苗结果一致。结果显示，动态浊度法用于甲肝疫苗细菌内毒素含量的检测是可行的。细菌内毒素试验凝胶定性法与动态浊度定量法都是药典规定的方法，凝胶法检测结果只能判断产品的内毒素是否超标，无法给出准确的含量，但不需要专门仪器;动态浊度法需要专用设备，但动态浊度法具有操作简便、重复性好、灵敏度高、检测范围广等优点，能快速、准确获知样品中的内毒素含量，且配有自动仪器检测和进行数据处理，还克服了凝胶法主观判断结果等因素影响，结果能保存，有利于制品质量控制［11-14］。在甲肝疫苗生产的中间控制环节推广使用动态浊度法进行定量检测，能够更加精确地反映疫苗生产各个环节制品的内毒素水平。动态浊度法以其高灵敏度、更低的检测下限、准确的定量而成为细菌内毒素检查法的发展方向。推广应用动态浊度法对保证甲肝疫苗质量和使用安全具有重要意义。

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Detection of Bacterial Endotoxin Content in Freeze-Dried Attenuated Hepatitis A Live Vaccine by Dynamic Turbidity Method

ZENG Yan，SUN Yang，LAN Yan，CUI Yue，DONG Li-zi，YANG Hong-yu
(Changchun Inst.of Bio-Products Co Ltd.，Changchun 130062)

The feasibility of dynamic turbidity method to detect bacterial endotoxin content in freeze dried attenuated hepatitis A live vaccine was investigated.According to Incoterms 1143 on Bacterial Endotoxin Detection Method in Chinese Pharmacopoeia Ver.2015，and the freeze-dried attenuated hepatitis A live vaccine for standard curve reliability test，interference initial screening test，interference verification test and the endotoxin content was determined，and compared with the results by gel method for verification of the same batch of vaccine.The reliability test results of standard curves accord with the regulations.Interference of early screening test，160 times and 320 times as well as 640 times dilution of the vaccine，the recovery rate was between 50%and 200%，all without interference，and accord with the requirement.Interference verification test has further proved that vaccine dilution 160 times had no interference effect on the test，the kinetic turbidimetric assay of 10 batches of hepatitis A vaccine bacterial endotoxin content were all less than the vaccine limits value of L=20 EU/mL，and verification by gel method for the same batch of vaccine results are consistent with.Therefore，it is feasible to detect the content of bacterial endotoxin in freeze-dried attenuated hepatitis A live vaccine by dynamic turbidity method，and it is worth the popularization and application.

kinetis-turbidimetric assay;bacteical endotoxin;freeze-dried attenuated hepatitis A live vaccine

Q939.93

A

1005－7021(2016)04－0062－05

10.3969/j.issn.1005－7021.2016.04.011

曾艳女，医学生物学工程师。主要从事生物制品质量检定工作。Tel:0431-87917255，E-mail:yuxiaonan1989@126.com

*通讯作者。男，副研究员。主要从事生物制品质量管理工作。Tel:0431-87917255，E-mail:YHY196606@163.com

2016-05-27;

2016-07-27