感音神经性聋基因治疗研究进展

马　骋　阮清伟

(复旦大学附属华东医院　上海市老年医学研究所，上海　200040)



感音神经性聋基因治疗研究进展

马骋阮清伟

(复旦大学附属华东医院上海市老年医学研究所，上海200040)

感音神经性聋；基因治疗；内耳

感音神经性聋(SNHL)是常见的内耳疾病，由多种发病因素引起，包括外界因素和遗传因素。外界因素，如噪声环境、全身性疾病、化学物质、不良饮食、吸烟嗜酒和耳毒性药物等导致噪音性、耳毒性及老年性聋。近年来，遗传因素所致的综合征性和非综合征性SNHL的影响受到越来越多的关注。随着分子遗传学技术的不断进步，研究人员发现许多与SNHL有关的基因，并通过各种模式生物实验揭示这些基因导致SNHL病理生理学机制。基因治疗和反义寡核苷酸是基于致聋基因，干预遗传性和获得性SNHL的重要治疗手段。在过去20余年中，研究人员采用不同的载体和非载体系统，通过不同的给予途径及不同的基因启动子强度将外源性遗传物质送到哺乳动物内耳，调节内耳细胞对应基因的表达水平和持续时间，恢复听觉器官的结构和功能〔1〕。本文重点对SNHL基因治疗进展，包括载体研究、外源基因给予途径和时机、候选基因及基因治疗存在的问题进行综述。

1　基因治疗概述

基因治疗是应用DNA重组技术，将人正常功能基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正、替代基因缺陷和异常，从而达到治疗疾病目的。该技术主要用于遗传病(如腺苷脱氨酶缺陷、血友病、囊性纤维病、家族性高胆固醇血症)和恶性肿瘤等的临床治疗。基因治疗策略包括：①基因矫正治疗。包括基因修正、基因置换和基因增补，其中基因增补，将正常基因整合到染色体中，补偿缺陷基因功能较易实现和最为常用。②基因调控治疗。药物使被抑制基因重新表达或抑制过度表达基因的表达；基因沉默技术，导入反义核酸(反义RNA结合靶mRNA，封闭其翻译，反义DNA结合靶DNA，封闭其复制与转录)，小干扰RNA(siRNA)(结合靶mRNA，使其降解)和微小RNA(miRNA)结合靶mRNA，封闭其翻译；核酶(能自我剪切的RNA)将mRNA 进行特异剪切，形成垂头和发夹状，破坏其作为翻译模板的作用。③免疫调节。导入免疫相关基因，增强免疫功能和抵抗力。④活化前体药物。导入的“自杀基因”产生一种酶，将无毒药物前体转变成细胞毒性药物，杀死受体细胞。⑤耐药基因治疗。抗药毒性基因导入肿瘤患者体内，使患者耐受更大剂量的化疗〔2〕。基因导入的方法有：①生物学方法。主要是利用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯性疱疹病毒为载体，介导目的基因进入生物细胞内，是最为常用的基因转移方法。腺病毒是目前基因治疗最为常用的载体，而逆转录病毒载体则应用最广泛、转基因效率最高〔3〕。②物理学方法，如通过裸DNA直接注射、微粒轰击、电穿孔和微注射等。肌肉注射是目前应用最为广泛和有效的接种途径。③化学方法。通过磷酸钙共沉淀、二乙氨基乙醇(DEAE)-葡聚糖转染和脂质体转染等使目的基因进入生物细胞。其中脂质体转染方法简便，可携带较大的DNA分子，比较安全，能转染的细胞类型也较多，但比病毒载体的转染效率低。对上述基因导入方法的选择时需满足：①转移效率高；②对分裂或非分裂相靶细胞转移特异性好；③能稳定地定点整合到宿主染色体上，同源重组最为理想；④能调控其适度表达，安全性较高，对人体不构成较严重危害；⑤易于操作。基因治疗有两条途径:①间接体内途径(体细胞介导的基因治疗)：体外将基因导入细胞内，再将该基因修饰的细胞回输病人体内，外源基因在体内表达，达到治疗或预防的目的。该方法的优点是较安全，效果易控制；缺点是技术复杂，难度大，不易推广。②直接体内途径：外源基因直接导入体内有关的组织细胞，使其进入相应的细胞并表达。优点是操作简便，易推广；缺点是疗效持续时间短，免疫排斥和安全性低等。截至2012年，基因治疗主要处于Ⅰ期试验阶段(占60.2%)，选择载体种类的前三位的是腺病毒(23.3%)、逆转录病毒(20.0%)和裸/质粒DNA(18.5%)。疾病的种类主要是癌症(64.7%)、单基因疾病(8.5%)，而神经科学疾病只有2%，且主要是帕金森病等中枢神经退行性变病。

2　SNHL基因治疗的候选基因

人类基因组学的研究进展，至今已鉴定60余个SNHL致病基因，这些基因将是基因治疗可能的靶点。特别是单基因性聋可表现为早期出现，或迟发型聋，显性或隐性，综合征或非综合征等多种耳聋类型，是基因治疗最为理想的候选基因。已知的基因属于不同的基因家族，包括转录因子，如产生反应氧有关的N-乙酰基转移酶2(NAT2*6A)转录因子粒状头样(GRHL)2〔4〕；小鼠无调同源(Math)1 基因是基因转录的调控因子，在毛细胞分化过程中起正相调控作用〔5〕。Kawamoto等〔6〕在豚鼠内耳导入Math1基因，Math1基因过表达后，在大上皮嵴区域有新的毛细胞出现，且发现有神经纤维在新生毛细胞的诱导下向其底部生长。在耳聋豚鼠内耳Math1基因过表达后会出现毛细胞再生，并伴有部分听力功能恢复〔7〕。C57小鼠毛细胞静纤毛功能相关的基因Cadherin23突变，将引起年龄相关的、快速的高频听力下降；许多Cadherin23的修饰基因和位点，如位于小鼠10号染色体Ahl1、位于小鼠5号染色体上的Ahl2基因和小鼠17号染色体的Ahl3等均能增加SNHL的易感性〔8～10〕。离子通道，如编码电压依赖的钾(Kv7.4)通道的KCNQ4〔11〕。转运子，如编码阴离子(氯离子/碘)转运子跨膜蛋白pendrin 的SLC26A4〔12〕。细胞外基质分子，如听觉上皮支持细胞间，耳蜗外侧壁连接组织间缝隙连接基因connexin突变诱导非综合征性聋，缝隙连接蛋白编码基因31(GJB3)基因突变会造成GJB3的细胞外区结构改变〔13〕。

其他的增加SNHL易感性基因还包括氧化应激相关的基因，如谷胱甘肽S转移酶(GST)，约50%以上的高加索人群是GST多态性(GSTM1)无义突变的基因型，这些个体高频耳声发射显示较低的振幅，易于遭受氧化应激损伤，因而更易出现听觉损伤〔14〕。N-乙酰化酶(NAT)涉及外源性毒性的调节，NAT基因遗传变异将增加氧化应激和外源性侵袭的易感性。编码NAT2酶基因在人群中分为快速的、中等和慢“乙酰化”表型，与听觉衰老相关〔15〕。多次实验验证mtDNA4977 的缺失与老龄化有关。线粒体12S rRNA由mtRNA含鸟嘌呤(G)的重链编码，最新研究显示，其基因突变能引发综合征型耳聋和非综合征型耳聋〔16〕。

Fukui等〔17〕通过实验发现，脑源性神经营养因子(BDNF)的基因转入能够在几乎所有神经元都退化的Pou4f3缺失的小鼠中增强听觉神经元的保护。在目前已有的实验案例中，在毛细胞缺失的情况下，残存的神经元依然表现出明显的神经纤维的生长至听觉上皮组织的现象。由此推断，这种神经生长和再生可能能够改善耳蜗植入治疗对于患有遗传性耳聋患者的疗效。过度表达X连锁的凋亡蛋白的抑制物(XIAP)能明显减轻噪音损伤和延缓老年性聋的发生〔18，19〕。

siRNAs是RNA干扰(RNAi)过程中的效应分子。siRNA双链与诱导沉默复合物(RISC)结合后裂解为siRNA单链，与siRNA单链完全互补结合的同源性靶mRNA被RISC剪切降解，从而达到基因沉默的目的。miRNAs是一类非编码小分子RNA，具有和siRNAs相似的功能，调节细胞内基因表达。其长度为19～25 nt。它通过与mRNA 上的靶位进行碱基互补配对使其目标mRNA出现降解或者翻译抑制现象〔20〕。miRNAs通过这种方式在人体各种发育和生理过程中起着重要的调节作用。目前已有研究表明，不同的调节蛋白在耳蜗形态的形成及其组织结构的形成中都发挥着重要作用，这些蛋白的表达和其之间的相互作用操纵着前体细胞分化，并调控其精确的发育过程〔21，22〕。研究表明，miRNAs在这种耳蜗的发育过程中同样发挥着重要作用〔23〕。在敲除大脑miRNAs加工过程中的一种重要酶Dicer的小鼠中，出现了毛细胞排列异常、耳蜗螺旋数减少及内耳畸形等异常现象，实验组也表现出轻微平衡障碍和听力丧失〔24〕。目前对于miRNAs调控耳蜗发育的分子机制尚未明确，待其机制明确后，miRNA治疗耳聋应当具有可行性。

Riazuddin等〔25〕通过基因分析发现非综合征耳聋和尤塞综合征1型耳聋的致病基因——CIB2蛋白。尤塞综合征是一种因基因缺陷而导致耳聋及由视网膜色素变性引起的视觉逐步减退的疾病。在小鼠中，CIB2蛋白存在于内耳毛细胞的感觉静纤毛、视网膜光感受器及色素上皮细胞，同钙结合的分子建模预测相同，CIB2显著减少异源性细胞中由三磷酸腺苷(ATP)诱导的钙离子反应，改变非综合征耳聋中的基因突变对钙离子反应的影响。此外，在斑马鱼和果蝇中，CIB2在毛细胞和视网膜感光细胞的功能和正常发育方面也是必不可少的。

3　SNHL基因治疗的给予途径和时机

内耳存在与血脑屏障相似的血耳蜗屏障，大大降低全身给予基因载体到达内耳的效率。在基因治疗应用的实现方面，还应注意基因导入内耳的不同方式，从而确定最简单有效的基因导入方法。研究发现，通过转基因载体将小鼠所需的基因以显微注射的方法导入圆窗膜内的内耳，完整的圆窗途径对耳蜗的损伤小，在临床上有较好的发展前景〔26〕。同样的方法也可以用于某些药物如生长因子、抗氧化剂的治疗，使其通过迷你泵显微注射至内耳〔27～29〕。然而，经圆窗膜途径进行基因转染并不是转染效率最高的途径，这主要是由于在鼓阶与中阶之间还存在细胞和紧密连接组成的基底膜。其他的导入途径还包括：耳蜗解剖后经鼓阶和前庭阶导入外淋巴中、经中阶导入内淋巴液中、经内淋巴囊导入等，其中，经耳蜗切除和镫骨底板途径，中阶导入比圆窗途径导入具有更高的转染效率〔1〕。

基因治疗的一个关键点在于实现毛细胞的再生，由此恢复听力。听觉损伤后，其病理可分为四个阶段：①毛细胞纤毛损伤阶段。此阶段毛细胞依然具备正常的生理特性，也是基因治疗介入的最好时机，毛细胞能够在纤毛再生或完全修复的基础上使其部分甚至全部功能恢复正常〔30，31〕；②毛细胞损伤，神经纤维和支持细胞几乎没有损伤。此阶段为基因治疗的关键时机，在此阶段导入Math1基因能够取得较好的效果〔32〕；③毛细胞严重损伤，神经纤维和支持细胞同样出现严重损伤。此阶段单个基因导入效果不佳，应考虑Math1基因联合其他多个因子导入，也可考虑导入干细胞〔33，34〕；④毛细胞、神经纤维及支持细胞严重损伤甚至消失。此阶段基因导入治疗将没有效果。

4　SNHL基因治疗的载体研究

SNHL基因治疗需要安全可靠且高效的基因载体。实验研究常用的基因载体包括病毒载体和非病毒基因载体。病毒载体是体内和体外基因导入能力最强的工具。有6种病毒家族经基因工程改造后用于体内和体外内耳基因转染的载体，如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、疱疹病毒、痘苗病毒和仙台病毒〔1，35～37〕。病毒载体的主要优势是较高的转染效率和不同的细胞靶向能力，从而限制特定的细胞亚群的转基因表达。主要缺陷是具有潜在的免疫学和遗传学毒性，引起炎症和基因插入性突变。腺病毒载体是一种无包膜的双链DNA病毒，适用于肿瘤基因治疗，体内基因治疗及疫苗等。其优点在于能够有效感染多种处于分裂期和有丝分裂后期的细胞，且制作简便易于培养，能够对靶基因长期并且高水平的表达，具有较强的植入能力；其缺点在于表达时间短，容易引起机体的抗病毒反应，致使细胞溶解。腺相关病毒载体是细小病毒家族中的一种复制缺陷型病毒，是一种单链DNA，适用于遗传病及慢性疾病的基因治疗。腺相关病毒同样能感染处于有丝分裂后期的细胞，且表达时间较长，较少出现免疫反应；缺陷在于基因植入的空间有限，可能会发生细胞融合。慢病毒载体是一种基于人类免疫缺陷病毒(HIV)的单链DNA病毒，不仅能有效地作用于分裂期的细胞，也能有效地作用于非分裂期的细胞，具有较好的转导效率、较强的植入能力和较低的免疫反应概率；缺点为易发生随即融合。疱疹病毒载体是一种由二十面体外壳和一个包膜包围的复杂双链DNA病毒，具有较大的基因容量和较好的神经亲和性，病毒滴度高，不易发生融合；不足之处在于转导效率较低，易出现基因重组。痘苗病毒载体是一种线性的双链DNA分子，同样具有较大的基因容量，但仅限于非小痘疫苗接种的个人。仙台病毒载体是一种单链RNA病毒，具有良好的转导效率，能快速被细胞吸收，但其基因植入空间有限〔1〕。

非病毒载体指通过自然或合成复合物，如DNA、蛋白质、多聚物或脂质体混合物能形成颗粒，有效地将基因导入细胞。该类系统进一步分为：①物理方法(无载体基因导入)，如阳离子脂质体、聚阳离子非脂质体。②化学方法(合成载体基因导入)包括电穿孔和基因枪等。非病毒载体是病毒载体简单、安全和更为灵活的替代工具。有实验研究用非病毒材料，如阳离子复合物作为载体，与质粒DNA，股寡核苷酸等结合形成纳米粒，能够模拟类似病毒的结构，使基因正常导入〔38〕。纳米粒聚合物作为基因载体进行基因转入的优势在于：①纳米粒能够保护核苷酸，使其不受核酸酶的作用而发生降解；②较强的生物亲和性能使其与靶向分子特异性耦联，实现基因的特异性治疗；③无毒性和免疫原性，代谢产物较少，不发生免疫排斥反应；④能够延长作用时间，维持核苷酸的浓度，有效提高生物利用率〔36〕。壳聚糖是甲壳素去乙酰化的产物，具有较好的生物相容性，能够在人体内代谢溶解，且其分级代谢产物对人体无毒害作用〔39，40〕。壳聚糖除能维持DNA的稳定，还能保护细胞膜及DNA不受溶酶体影响发生降解。因此壳聚糖可以用于制作基因导入的载体，并能有效提高转染率。目前已有实验成功使用壳聚糖作为载体导入Math1基因，其在临床治疗耳聋方面的应用尚待进一步研究。非病毒载体技术似乎更为广泛地用作基因功能鉴定的基础研究。基于这些技术在体低的转染效率、缺乏细胞特异性、表达时间短及细胞毒性，目前发展为基因治疗载体可能性不大。

5　SNHL基因治疗存在问题及前景

基因治疗已取得很大进展，为遗传病和肿瘤的治疗提供一种新手段，但仍面临一些关键问题。①有效的特异目的基因太少。SNHL是由遗传和环境多因素共同作用引起，不像单基因遗传病，在特定治疗基因的选择上十分困难。SNHL更多的可能源于多基因、多突变的累积效应复杂性遗传疾病，至今仍然有大约70%的耳聋病因尚不清楚。②基因运载的高效性。缺乏高效的载体系统，逆转录病毒不能感染非分裂细胞。非病毒载体在体转染耳蜗内细胞效率过低。③基因运载的靶向问题。如感染正常细胞，可能改变其功能。④目的基因在体内表达时效性难以有效控制。除腺相关病毒能定点整合到细胞基因组外，逆转录病毒尽管能整合到分裂细胞基因组，但是随机性的；而其他病毒载体不能整合到细胞的基因组中。⑤导入基因的稳定性有待进一步研究。⑥导入外源基因对机体的影响。如腺病毒具强的免疫原性，腺相关病毒具有中度的免疫原性。单纯性疱疹病毒能靶向神经组织，但具有细胞毒性〔1〕。

尽管如此，基因治疗在听觉系统基础研究领域仍然是十分重要的研究工具。当缺乏能在时间和空间上控制特定基因的过度表达或沉默的合适的小鼠模型时，通过内耳局部的基因转染，在不影响其他组织的前提下同样可达到研究内耳发育、细胞生存和再生过程中单个基因的功能。在病毒载体方面，腺相关病毒是临床病人实验中最有潜力的基因治疗载体，比其他病毒载体具有更高的转染毛细胞和神经节的效率。非病毒载体系统转染内耳细胞的量及选择性都还不足以用于基因治疗。在未来的研究中，应该更加深入地研究内耳毛细胞损伤及其损伤后再生的机制和过程，通过单基因导入或联合多基因导入，筛选出对听觉损伤起到有效恢复作用的基因。此外，在保证安全的情况下，研发出对SNHL基因治疗的高效基因载体。其中，纳米颗粒载体是一个很好的研发方向，其对于很多外源性和内源性的内耳疾病可能会展现出较大的优势。

1Sacheli R，Delacroix L，Vandenackerveken P，etal.Gene transfer in inner ear cells：a challenging race〔J〕.Gene Ther，2013;20(3)：237-47.

2李立家，肖庚富.基因工程〔M〕.北京：科学出版社，2004:146-79.

3邱丽筠，俞淑文，张芳,等.基因治疗载体的最新研究进展〔J〕.中华实用医药寻志,2004;4(1)：10-2.

4Van Laer L，Van Eyken E，Fransen E，etal.The grainyhead like 2 gene (GRHL2)，alias TFCP2L3，is associated with age-related hearing impairment〔J〕.Hum Mol Genet,2008;17(2)：159-69.

5Zheng JL，Gao WQ.Overexpression of Math1 induce robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears〔J〕.Nat Neurosci，2000;3(6)：580-6.

6Kawamoto K，Ishimoto S，Minoda R，etal.Math1 gene transfer generates new cochlear hair cells in mature guinea pigs in vivo〔J〕.J Neurosci，2003;23(11)：4395-400.

7Izumikawa M，Minoda R，Kawamoto K，etal.Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals〔J〕.Nat Med，2005;11(3)：271-6.

8Johnson KR，Erway LC，Cook SA，etal.A major gene affecting age-related hearing loss in C57BL/6J mice〔J〕.Hear Res，1997;114(1-2)：83-92.

9Johnson KR，Zheng QY.Ahl2，a second locus affecting age-related hearing loss in mice〔J〕.Genomics，2002;80(5)：461-4.

10Nemoto M，Morita Y，Mishima Y，etal.Ahl3，a third locus on mouse chromosome 17 affecting age-related hearing loss〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2004;324(4)：1283-8.

11Van Eyken E，Van Laer L，Fransen E，etal.KCNQ4：a gene for age-related hearing impairment〔J〕? Hum Mutat,2006;27(10)：1007-16.

12Dai P，Stewart AK，Chebib F，etal.Distinct and novel SLC26A4/Pendrin mutations in Chinese and U.S.patients with nonsyndromic hearing loss〔J〕.Physiol Genomics,2009;38(3)：281-90.

13Estivill X，Fortina P，Surrey S,etal.Connexin-26 mutations in sporadic and inherited sensorineural deafhess〔J〕.Lancet，1998;351(9100)：394-8.

14Pemble S，Schroeder KR，Spencer SR，etal.Human glutathione S-transferase theta (GSTT1)：cDNA cloning and the characterization of a genetic polymorphism〔J〕.Biochem J,1994;300(Pt 1)：271-6.

15Unal M，Tamer L，Dogruer ZN，etal.N-acetyltransferase 2 gene polymorphism and presbycusis〔J〕.Laryngoscope,2005;115(12)：2238-41.

16Someya S,Yamasoba T，Kujoth GC，etal.The role of mtDNA mutations in the pathogenesis of age-related hearing loss in mice carrying a mutator DNA polymerase gamma〔J〕.Neurobiol Aging,2008;29(7)：1080-92.

17Fukui H，Wong HT,Beyer LA,etal.BDNF gene therapy induces auditory nerve survival and fiber sprouting in deaf Pou4f3 mutant mice〔J〕.Sci Rep,2012;2:838.

18Wang J，Tymczyszyn N，Yu Z，etal.Overexpression of X-linked inhibitor of apoptosis protein protects against noise-induced hearing loss in mice〔J〕.Gene Ther,2011;18(6)：560-8.

19Wang J，Menchenton T，Yin S，etal.Over-expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein slows presbycusis in C57BL/6J mice〔J〕.Neurobiol Aging,2010;31(7)：1238-49.

20Eulalio A，Huntzinger E，Izaurralde E.Getting to the root of miRNA-mediated gene silencing〔J〕.Cell，2008;132(1):9-14.

21Fritzsch B，Beisel KW，Pauley S,etal.Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear〔J〕.Int J Dev Biol，2007;51(6-7)：663-78.

22Kelley MW.Cellular commitment and differentiation in the organ of Corti〔J〕.Int J Dev Biol，2007;51(6-7):571-83.

23Amaral PP，Dinger ME，Mercer TR,etal.The eukaryotic genome as an RNA machine〔J〕.Science，2008;319(5871):1787-9.

24Soukup GA，Fritzsch B，Pierce ML,etal.Residual microRNA expression dictates the extent of inner ear development in conditional Dicer knockout mice 〔J〕.Dev Biol，2009;328(2)：328-41.

25Riazuddin S，Belyantseva IA，Giese AP，etal.Alterations of the CIB2 calcium-and integrin-binding protein cause Usher syndrome type 1J and nonsyndromic deafness DFNB48〔J〕.Nat Genet,2012;44(11):1265-71.

26Lalwani AK，Jero J，Mhatre AN.Current issues in cochlear gene transfer〔J〕.Audiol Neurootol，2002;7(3)：146-51.

27Wang J，Dib M，Lenoir M，etal.Riluzole rescues cochlear sensory cells from acoustic trauma in the guinea-pig〔J〕.Neuroscience，2002;111(3)：635-48.

28Lefebvre PP，Staecker H，Van de Water T，etal.Pharmacologic treatment of inner ear：from basic science to the patient〔J〕.Acta Otorhinolaryngol Belg，2002;56(1)：45-9.

29Bowers WJ，Chen X，Guo H，etal.Neurotrophin-3 transduction attenuates cisplatin spiral ganglion neuron ototoxicity in the cochlea〔J〕.Mol Ther，2002;6(1)：12-8.

30Jia S，Yang S，Guo W，etal.Fate of mammalian cochlear hair cells and stereocilia after loss of the stereocilia〔J〕.J Neurosci，2009;29(48)：15277-85.

31李丽贤，杨仕明，孙建和,等.出生后大鼠听毛细胞纤毛发育过程〔J〕.中华耳科学杂志，2009;7(4)：318-23.

32陈伟，郭维维，胡吟燕,等.Math1基因内耳导入后噪声性聋豚鼠听功能改变观察〔J〕.中华耳科学杂志，2009;7(4)：352-6.

33郭维维，杨仕明，翟所强.bFGF/Math1 基因表达载体的构建及在大鼠耳蜗中的表达〔J〕.听力学及言语疾病杂志，2005;13(2)：107-9.

34秦贺，杨仕明，赵立东,等.大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与初步鉴定〔J〕.中华耳科学杂志，2009;7(4)：357-61.

35Wang H，Shi HB，Yin SK.Polyamidoamine dendrimers as gene delivery carriers in the inner ear：how to improve transfection efficiency〔J〕.Exp Ther Med,2011;2(5)：777-81.

36Wang H，Murphy R，Taaffe D，etal.Efficient cochlear gene transfection in guinea-pigs with adeno-associated viral vectors by partial digestion of round window membrane〔J〕.Gene Ther,2012;19(3)：255-63.

37Ruan Q，Chen D，Wang Z，etal.Effects of Kir2.1 gene transfection in cochlear hair cells and application of neurotrophic factors on survival and neurite growth of co-cultured cochlear spiral ganglion neurons〔J〕.Mol Cell Neurosci,2010;43(3)：326-39.

38Wada K，Arima H，Toshihito T,etal.Improvement of gene delivery mediated by mannosylated dendrimer/a-cyclodextrin conjugates〔J〕.J Control Release，2005;104(2)：397-413.

39Wu Y，Yang W，Wang C，etal.Chitosan nanoparticles as a novel delivery system for ammonium glycyrrhizinate〔J〕.Int J Pharm，2005;295(1-2)：235-45.

40Kiang T，Wen J，Lim HW,etal.The effect of the degree of chitosan deacetylation on the efficiency of gene transfection〔J〕.Biomaterials，2004;25(22)：5293-301.

〔2015-01-27修回〕

(编辑王一涵)

阮清伟(1965-)，男，主任医师，博士,主要从事衰老与认知功能损害研究。

马骋(1989-)，女，硕士，主要从事衰老与认知功能损害研究。

R764.43+1

A

1005-9202(2016)15-3848-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.112