老年冠心病患者载脂蛋白B基因多态性与血脂关系的研究

李晓波 李燕

冠心病(coronary heart disease，CHD)是临床上最常见的心血管疾病，发病率和病死率都很高，严重威胁人类健康。冠心病是指由于冠状动脉粥样硬化导致心肌缺血、缺氧而引起的心脏病，而脂质代谢异常与动脉粥样硬化密切相关。目前研究表明，甘油三酯、脂蛋白a、低密度脂蛋白水平升高，高密度脂蛋白水平降低，有助于动脉粥样硬化形成[1]。载脂蛋白在冠心病发生发展中的作用也日愈受到关注，陈兰等研究认为，载脂蛋白A1(Apolipoprotein A1，Apo A1)、载脂蛋白 B(Apolipoprotein B，ApoB)浓度与发展成CHD的危险性及病变程度相关[2]。本研究用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术对67例冠心病和37例对照组进行ApoB基因EcoRⅠ多态性的检测，同时应用生物化学的方法检测两组的血脂水平，以探讨ApoB基因多态性与冠心病的关系及其对血脂水平的影响，以便遗传学角度了解基因变异在冠心病发生、发展中的作用，为冠心病的预防及诊治提供遗传学依据。

材料与方法

一、研究对象

所有研究对象均为2013年7月至2016年1月间收入我科的住院患者，分为冠心病组和对照组。冠心病组，均根据病史、临床表现、心电图、心肌酶谱或冠状动脉造影等明确诊断，入选对象均无肝肾疾病、严重感染、恶性肿瘤、血液病、内分泌病、结缔组织病、营养不良等疾病。

二、方法

(一)ApoB基因的检测

1.基因组DNA的提取：清晨采集空腹静脉血加入EDTA抗凝，经淋巴细胞分离液分离外周血有核细胞，用上海生物公司的UNIQ-10小量柱式基因组DNA抽提试剂盒抽提所有样本的基因组DNA。

2.引物设计

BE1：5′-TGGGAACACACAGGGCTCAC-3′

BE2：5′-CCGTCCCTACCTCCCTTATGA-3′

3.PCR扩增：扩增ApoB基因长412bp的DNA片段，包含一个EcoRⅠ多态性酶切位点，用E来表示。PCR反应体系：2.5mmol/LMgCl2，1μg基因组 DNA，1∪TaqDNA聚合酶，两侧引物各1μmol/L，200μmol/LdNTP和1×反应缓冲液，总体积为25μL。反应体系混匀后在PROGENEⅡ型扩增仪中进行热循环：94℃预变性5min，94℃变性 30s，60℃退火30s，延伸1min，35个循环后72℃保温5min结束反应。以2％琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物。

4.DNA多态性分析：PCR扩增产物经EcoRⅠ酶切，37℃消化过夜。酶解完全可获得2个片段，长度分别为274bp及138bp。PCR-RFLP产生3种基因型：产生片段长度为274bp及138bp两条带的是E＋E＋纯合型；出现274bp、138bp及412bp三条带的是E＋E-杂合型；仅见412bp一条带的是无酶切位点的E-E-纯合型(见下图)。

ApoB基因EcoRⅠ酶切图谱

(二)血脂水平的测定

所有对象均抽取空腹12h以上的静脉血，分离血清后用生物化学方法对血浆总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白B和脂蛋白a水平进行测定。

(三)数据处理

采用SPSS软件包建立数据库，冠心病组与对照组组间均衡比较用χ2检验及两样本t检验。等位基因频率用基因计数法，等位基因频率及基因频率符合Hardy-Weinberg平衡定律。两组间等位基因频率、基因型频率分布处理均用χ2检验。组间血脂水平计量数据处理用两样本t检验。

结 果

一、ApoB基因多态性分布

(1)ApoB基因EcoRⅠ位点多态性在冠心病组及对照组均以E＋E＋基因型占优势，两组的基因型频率分布未见明显差异(见表1)。

(2)ApoB基因EcoRⅠ位点多态性在冠心病组及对照组均以E＋等位基因占优势，两组的等位基因频率分布未见明显差异(见表2)。

表1 ApoB基因EcoRⅠ位点基因型频率在冠心病组与对照组组间的分布

表2 ApoB基因EcoRⅠ位点等位基因频率在冠心病组与对照组组间的分布

二、冠心病组与对照组血脂水平比较

冠心病组与对照组血脂水平比较结果如下：甘油三酯水平有显著性差异，总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白A、载脂蛋白B及脂蛋白a水平无明显差异(见表3)。

表3 冠心病组与对照组血脂水平比较

讨 论

冠心病是动脉粥样硬化所致，冠状动脉之所以易于发生粥样硬化，可能是：(1)该动脉内膜和部分中膜的血供由管腔直接供给，血中的氧和营养物质直接透入内膜和中膜，因而脂质亦易于透入。(2)该动脉与主动脉的交角几乎成直角，其近端及主要分支的近端受到的血流冲击大，因而易于损伤[3]。动脉粥样硬化是多种因素所致的疾病，其发生与遗传和环境因素有关。在形成动脉粥样硬化的多种因素中，血脂代谢异常起着重要的作用。ApoB是分子量最大的、含氨基酸最多的、序列最后测出的人体内重要的载脂蛋白，其主要成分是ApoB100，ApoB100是其基因的全序列翻译产物。ApoB是LDL受体的专一性配体，参与脂质代谢的过程。一旦编码apoB的遗传物质发生了变化，一方面可引起apoB结构的变化，不能识别LDL受体而引发LDL水平升高，另一方面则会引起脂质代谢紊乱：apoB100、LDL水平增高，胆固醇进入外周组织，高密度脂蛋白胆固醇水平降低，从而促进动脉粥样硬化的发生和发展。

ApoB基因位于人第2号染色体短臂，全长43kb，含有28个内含子和29个外显子，有显著性差异和明显的多态性。目前研究表明，ApoB基因的一个或几个位点的微小变异或缺陷都会引起个体血脂增高，最后导致动脉粥样硬化或者冠心病。ApoB基因多态性类型有限制性片段长度多态性(RFLP)、信号肽编码Ins/Del多态性、数目可变的串联重复序列(VNIR)、单链构象多态性(SSCP)和微卫星多态性等，均广泛应用在脂类代谢和相关疾病的研究中。RFLP包括XbaⅠ酶切多态性、MspⅠ酶切多态性和EcoRⅠ酶切多态性等。ApoB的EcoRⅠ酶切位点位于29号外显子，由于cDNA的第12669位核苷酸G到A突变，使原有的EcoRⅠ酶切点消失，产生E-等位基因，并使第4154位的氨基酸残基谷氨酸为赖氨酸取代，使GAA被AAA取代，如不发生突变则为E＋等位基因。目前，对于ApoB的EcoRⅠ酶切位点多态性与冠心病的关系，国内外研究结果还存在争议，大多数认为两者间无相关性，但也有一部分研究认为两者相关。本次研究用PCR技术对67例冠心病和37例对照组进行ApoB基因EcoRⅠ多态性的检测，同时用生物化学的方法检测两组的血脂水平，观察到冠心病组与对照组甘油三酯水平比较有显著性差异；ApoB基因EcoRⅠ酶切位点均以E＋E＋为主要基因型；老年冠心病组与对照组的ApoB基因多态性比较无显著性差异。结果提示冠心病与血脂代谢异常明显关联；ApoB基因EcoRⅠ酶切位点多态性与冠心病无相关性。Saha等[4]报道过新加坡华人ApoB基因的RFLPs与冠状动脉粥样硬化患者血清脂质、脂蛋白和载脂蛋白的水平改变无关，本研究结果与其相似。而韦玉兰等报道[5]，广西地区人群冠心病、脑梗死的发生与EcoRⅠ酶切位点基因突变有关。叶平等[6]对中国汉族人群的研究发现，冠心病组中E-等位基因相对频率高于正常对照组。研究结果不同的原因可能是基因多态性的分布存在地区和种族的差异，从而造成不同地区不同种族对疾病的易感性不同。或许下一步对冠心病与载脂蛋白基因多态性的研究需要联合多基因及多位点进行。

[1] KoltringerP，Jurgens G.Dominant role of lipoprotein(a)in the investigation and evaluation of parameters indicating the development of cerial atherosclerosis[J].Atherosclerosis，1985，58：187.

[2] 陈兰，陈彪.APOA、APOB与冠心病的关系[J].中国热带医学，2004，4(5)：777.

[3] 陈灏珠.实用内科学[M].第10版.北京 ：人民卫生出版社，1997：1226.

[4] Saha IV.Apolipoprotein B gene DNA polymorphisms(Xba Iand EcoRI)，serum lipids，and apolipoproteins in healthy Chinese[J].Genet Epidemiol，1992，9：1.

[5] 韦玉兰，钟卫干.黄艳明，等.载脂蛋白B基因第29外显子EcoRI位点基因变异与冠心病、脑梗死易感性的研究 [J].广西中医学院学报，2007，10(1)：5-7.

[6] 叶平，王士雯，陈保生，等.载脂蛋白B基因多态性与冠心病关系的研究[J].中华心血管病杂志，1994，22(2)：119-121.