TRF1、TRF2及POT1 mRNA在前列腺癌组织中的表达及临床意义

2016-01-31王英磊张莹莹范成娟张任亚赵战魁

中国老年学杂志 2016年21期

关键词：正态端粒泌尿外科

王英磊张莹莹孟琳肖琳范成娟李磊张任亚赵战魁

(济宁医学院附属医院泌尿外科，山东济宁 272000)

TRF1、TRF2及POT1 mRNA在前列腺癌组织中的表达及临床意义

王英磊张莹莹1孟琳肖琳范成娟李磊2张任亚2赵战魁

(济宁医学院附属医院泌尿外科，山东济宁 272000)

目的探讨端粒重复序列结合蛋白质(TRF)1、TRF2和端粒保护蛋白1(POT1)mRNA在前列腺癌(PCa)组织中的表达及临床意义。方法选择行尿道前列腺电切术切除的PCa患者中心组织标本55例作为实验组；同期选择55例前列腺增生(BPH)患者病理组织标本作为对照组。通过免疫组化法测定PCa患者肿瘤组织中TRF1、TRF2和POT1 mRNA的表达情况。结果实验组TRF1 mRNA明显高于对照组(P<0.05)，两组TRF2 mRNA差异无统计学意义(P<0.05)，实验组POT1 mRNA明显高于对照组(P<0.05)。结论 PCa患者组织中TRF1和POT1 mRNA表达上升，说明它们的高表达可能与PCa发生发展密切相关；而PCa患者组织中TRF2的mRNA表达并没有发生明显变化，其作用机制还有待进一步研究。

端粒重复序列结合蛋白质1；端粒重复序列结合蛋白质2；端粒保护蛋白1；前列腺癌

目前对于前列腺癌(PCa)的致病机制并未完全阐明，但研究发现端粒重复序列结合蛋白质(TRF)1、TRF2和端粒保护蛋白(POT)1与颅内肿瘤、胃癌等多种肿瘤发生、发展密切相关〔1〕。本文通过测定PCa患者肿瘤组织中TRF1、TRF2和POT1的表达，分析其与PCa的关系，从而深入了解PCa的发病及转移机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2014年9月至2015年3月我院行尿道前列腺电切术切除的PCa中心组织标本55例作为实验组，年龄56～85〔平均(68.4±6.2)〕岁。所有患者均符合第28届欧洲泌尿外科学会制定的《欧洲泌尿外科学会前列腺癌诊疗指南》〔2〕的诊断标准，且术后病理组织切片确诊为前列腺癌，术前均未进行内分泌治疗、化疗以及放疗。同期选择55例前列腺增生(BPH)患者病理组织标本作为对照组，年龄53～82〔平均(66.9±5.7)〕岁。两组患者年龄等基线资料无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。所有实验对象均知情同意，且经我院伦理委员会批准。

1.2 主要器材和试剂 Trizol(大连Takara工程有限公司)；逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂(上海碧云天生物技术有限公司)；荧光定量PCR仪(瑞士罗氏lightCycler 96荧光定量PCR)；PCR试剂(2×Taq Mster Mix，金斯瑞生物科技有限公司)；超微量分光光度计(美国Thermo Scientific NanoDrop 2000)；凝胶成像仪(BIO-RAD)。

1.3 方法 (1)剪取100 mg病理组织于匀浆器中，加入1 ml Trizol试剂，在冰上做匀浆处理。然后将匀浆液转入1.5 ml的EP管中，RNA溶于10 μl 0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水中，58℃助溶5 min。测定RNA浓度，然后用超微量分光光度计测定其A260/A280比值以及浓度，按照逆转录试剂盒操作说明书步骤合成cDNA。(2)按照引物设计原则，应用引物设计软件Primer 5.0设计TRF1、TRF2、POT1和β-actin引物，通过Blast软件分析，去除与其他基因同源的系列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系25 μl，反应参数：2×Taq Mster Mix(12.5 μl)；上、下游引物各1 μl(0.25 μmol/L)；cDNA(2 μl)，ddH2O(8.5 μl)，共40个循环。PCR过程中加一个无模板空白对照组。所有检测均由相关的专业人士严格按照试剂盒说明书的要求步骤进行操作。

1.4 统计学方法两组的TRF1、TRF2和POT1的mRNA表达水平采用荧光定量PCR的CT值与β-actin mRNA的CT值之差(ΔCT)表示，采用SPSS19.0软件行Shapiro-Wilk检验其是否符合正态性：满足正态性检验数据，采用两独立样本t检验；不满足正态性检验数据，采用Wilcoxon秩和检验进行分析。

2 结果

2.1 两组患者TRF1表达水平的比较两组病理组织TRF1的ΔCT值进行正态性检验，发现其均不满足正态性(W=0.824,P=0.000；W=0.875，P=0.000)，对照组患者25%、50%和75%的ΔCT值分别为0.473、1.017、2.015；实验组分别为0.815、1.652、3.482。Wilcoxon秩和检验分析发现，实验组TRF1的ΔCT明显高于对照组(Z=3.413，P=0.001)。

2.2 两组患者TRF2表达水平的比较两组病理组织TRF2的ΔCT值进行正态性检验，发现其均不满足正态性(W=0.886,P=0.001；W=0.934，P=0.009)，对照组患者25%、50%和75%的ΔCT值分别为6.273、8.147、9.775；实验组分别为5.842、8.505、10.248。秩和检验分析两组患者ΔCT无统计学差异(Z=1.726，P=0.091)。

2.3 两组患者POT1表达水平比较两组病理组织POT1的ΔCT值进行正态性检验，发现其均不满足正态性(W=0.956,P=0.061；W=0.962，P=0.168)，两独立样本t检验分析发现，实验组POT1的ΔCT(4.598±1.157)明显高于对照组(3.457±1.014)(t=3.491，P=0.001)。

3 讨论

端粒在肿瘤的发生和发展中发挥十分重要的作用，主要通过端粒的缩短限制细胞的增殖从而抑制癌变，然而端粒的过分缩短又会导致基因组不稳定，而增加细胞癌变概率，因此调节端粒功能是治疗癌症的一个新的研究方向〔3〕。TRF1和TRF2对端粒的结构和功能起很大的作用，影响肿瘤细胞中端粒长度的维持和延长〔4〕；而POT1通过对端粒酶、端粒长度的调节等方式影响肿瘤的发生、发展和细胞凋亡〔5〕。

TRF1与TRF2均为端粒DNA重复序列结合因子。其中TRF1通过二聚体的形式结合在T环上，通过控制在端粒DNA上结合的数量来调节端粒酶在端粒末端的作用。此次实验说明TRF1基因的过度表达可能会促进PCa的发生和发展，这与Lee〔6〕研究发现TRF1基因在癌细胞中的表达高于正常细胞结果一致。而TRF2通过二聚体的形式结合在D环上，通过维持端粒功能性单链3'-G尾的稳定来防止其自身融合，从而保护了染色体的完整性。本研究发现TRF2基因表达与PCa发生发展关系并不密切。这与全晓红〔7〕研究发现TRF2在食管癌与正常组织中表达没有差异相一致的，有待进一步深入研究POT1可以和端粒DNA单链发生特异性结合，使端粒的3'端单链突出并折回，插入其内部某一重复序列的区域，替换出自身链，然后形成稳定T环结构，覆盖于端粒的末端，使其避免DNA修复酶降解以及末端融合，从而保护端粒的结构和功能完整性。目前对于PCa组织中POT1表达的研究并不多见。本研究发现POT1 mRNA表达上升与PCa发生关系密切。这可能是POT1的mRNA表达增加后POT1蛋白表达减少，导致T-loop不稳，引起DNA损伤修复过度活化，造成细胞染色体畸变，甚至癌基因激活促进肿瘤的发生〔8〕。

综上所述，PCa患者组织中TRF1和POT1 mRNA表达上升，说明它们的高表达可能与PCa发生发展密切相关；而PCa患者组织中TRF2 mRNA表达并没有发生明显变化。

1 张梦云,周京国,青玉凤,等.端粒重复序列结合蛋白质1与2在原发性干燥综合征患者外周血单个核细胞中的表达及其临床意义〔J〕.中华临床医师杂志:电子版,2013;7(21):9485-8.

2 谢立平,陈弘.2013年欧洲泌尿外科学会年会前列腺癌诊断治疗进展〔J〕.中华泌尿外科杂志,2013;34(10):727-31.

3 王英磊,逄淑超,张莹莹,等.TRF1、TRF2和POT1基因mRNA在前列腺癌组织中的表达〔J〕.现代生物医学进展,2015;15(23):4518-20,4524.

4 周建斌,胡华,盛顺良,等.端粒蛋白TRF1、TRF2和TIN2在宫颈鳞癌中的表达及意义〔J〕.中南医学科学杂志,2013;41(2):124-6.

5 席小英,张三元.醋酸丙氨瑞林对人子宫内膜癌裸鼠移植瘤的作用以及端粒保护蛋白1表达的影响〔J〕.中华临床医师杂志:电子版,2015;9(7):1152-6.

6 Lee K.Abstract 579:The interaction of ZSCAN4 with TRF1:effects on regulation of telomere elongation in cancer cells〔J〕.Cancer Res,2013;73(6):579.

7 全晓红.端粒重复序列结合因子1和2及端粒保护蛋白1基因在食管癌中的表达〔J〕.中国医学工程,2014;22(2):60-1.

8 青玉凤,周京国,邢艳,等.系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞端粒保护蛋白TPP1及POT1基因表达的研究〔J〕.中华风湿病学杂志,2010;14(1):56-9.

〔2015-12-18修回〕

(编辑袁左鸣)

济宁市科技计划(医疗卫生)项目(No.2014jnjc15)