ACTL8的表达与乳腺癌临床病理特征及预后的关系*

贺立彩，　朱真锋，　郑倩倩，　陈　尚，　顾海华

(温州医科大学检生学院，浙江 温州 325035)



ACTL8的表达与乳腺癌临床病理特征及预后的关系*

贺立彩，朱真锋，郑倩倩，陈尚，顾海华△

(温州医科大学检生学院，浙江 温州 325035)

[摘要]目的： 探讨肌动蛋白样蛋白8(ACTL8)在乳腺癌中的表达及其与乳腺癌临床病理特征及预后的关系。方法: 采用Western blot方法检测人正常乳腺上皮细胞株MCF-10A和5种乳腺癌细胞株中ACTL8蛋白的表达；采用免疫组织化学方法检测6例乳腺癌标本及其对应的癌旁组织中ACTL8蛋白的表达；收集TCGA乳腺癌数据集，将488例乳腺标本纳入,分析ACTL8的mRNA表达水平与乳腺癌患者临床病理特征及预后的关系。结果: ACTL8蛋白在乳腺癌细胞株T47D、BT474、HCC1954和SKBR3中表达显著高于乳腺上皮细胞株MCF-10A；ACTL8蛋白在乳腺癌组织中的表达也显著高于癌旁组织；ACTL8 mRNA表达与乳腺癌患者年龄、肿瘤大小、临床TNM分期和淋巴结转移相关(P<0.05)。ACTL8 mRNA高表达的乳腺癌患者5年内生存率低、预后差。结论: ACTL8在乳腺癌组织中高表达并与乳腺癌临床病理特征及预后密切相关，提示ACTL8可作为判断乳腺癌预后的标志物。

[关键词]乳腺癌； 肌动蛋白样蛋白8； 临床病理特征； 预后

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率正呈逐年上升势头。乳腺癌是女性中发病率最高的肿瘤，2013年共有180万乳腺癌新发病例，46.4万乳腺癌死亡病例[1]。中国乳腺癌每年新增病例占世界乳腺癌的12.2%，每年乳腺癌死亡病例占总死亡的9.6%[2]。因此深入研究乳腺癌的发生发展机制，寻找新的潜在治疗靶点对预防乳腺癌的复发和转移及改善患者预后具有非常重要的意义。

癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen，CTA)是在肿瘤组织中特异性表达，而在除睾丸或胎盘以外的正常组织中几乎不表达的抗原[3-4]。研究表明，一些CTA 与肿瘤的发生发展密切相关，如肺腺癌中NY-ESO-1和 MAGE-A3 的表达与不良预后相关[5]；在膀胱癌中，肿瘤的浸润程度越高，MAGE基因家族的表达量越高[6]；肿瘤的病理核分裂象越高，NY-ESO-1的表达越高[7]。肌动蛋白样蛋白8(actin-like protein 8, ACTL8)是actin相关蛋白家族成员之一，主要参与actin的折叠以及纺锤体的形成，核分裂和染色体的形成。Yao等[8]发现ACTL8为CTA家族成员之一。查阅国内外文献有关ACTL8与肿瘤的发展及预后的相关研究较少，且ACTL8在乳腺癌中的表达及其与乳腺癌发生发展及预后的关系也尚不清楚。本研究通过检测ACTL8在乳腺癌中的表达并分析其与乳腺癌的发生发展及预后的关系，以期提供判断乳腺癌预后的标志物。

材料和方法

1细胞

人正常乳腺上皮细胞株MCF-10A及乳腺癌细胞株(T47D、BT474、SKBR3、HCC1954和MDA-MB231)均购自ATCC。

2病例收集

用于免疫组化的乳腺癌样本来源于温州医科大学第一附属医院病理科2015年3月～2015年6月的乳腺癌石蜡标本，患者均为女性。用于临床病理特征及预后分析的病例样本来源于TCGA乳腺癌数据集，此数据集共含593例组织标本，其中有105例标本的肿瘤大小、淋巴结转移情况、TNM分期及总生存时间信息不完善。因此我们纳入分析标本488例，包括427例乳腺癌组织样本和61例正常乳腺组织样本。

3主要试剂

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自HyClone；培养基DMEM、DMEM/F12、 MEM和RPMI-1640均购自Gibco；青霉素-链霉素(P/S)双抗、HRP-鼠 II 抗和兔 II 抗购自碧云天生物技术公司；ACLT8多克隆抗体购自上海生工生物技术有限公司；tubulin鼠源单克隆抗体购自Sigma；即用型SABC-POD(兔IgG)试剂盒购自武汉博士德；DAB试剂盒购自中杉金桥。

4主要方法

4.1细胞培养MCF-10A的培养液是DMEM/F12+5% FBS+insulin 1.8 g/L +1% P/S+hydrocoritisone 3.2 g/L。HCC1954的培养液为RPMI-1640 +10% FBS+1% P/S。SKBR3、T47D、BT474的培养液为DMEM+10% FBS+1% P/S。MDA-MB231的培养液为MEM+5% FBS+insulin 1.8 g/L+1% P/S。按照以上配方，细胞置于37 ℃、5% CO2、95% O2的培养箱中常规培养。

4.2Western blot实验收集各细胞，细胞裂解液提取总蛋白，行SDS-PAGE，电泳结束后将凝胶电转移到PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉的TBST液封闭PVDF膜1 h。分别加入相应的 I 抗，4 ℃摇床孵育过夜。第2天将膜用TBST洗3次，每次10 min。加入HRP标记的相应 II 抗(1∶2 000)，室温孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。将PVDF膜置于ECL试剂中反应1～3 min，经超灵敏化学发光成像分析仪(Bio-Rad凝胶成像系统)扫描得到目的条带。

4.3免疫组织化学染色标本经4%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片。65 ℃拷片1 h，二甲苯脱蜡及梯度脱水后，用pH=6.0的柠檬酸缓冲液高压修复5 min，PBS洗3次， 3%过氧化氢封闭8 min，PBS洗3次，5% BSA封闭20 min，抗ACLT8兔源多克隆抗体(1∶100)4 ℃孵育过夜，第2天PBS洗3次，后用链霉素标记的山羊抗兔 II 抗常温孵育30 min，PBS洗 3次，SABC增强剂常温孵育30 min，PBS洗 3次，DAB试剂显影5 min终止，苏木素复染细胞核后脱水、封片。ACTL8存在于细胞浆中，出现棕黄色染色即为阳性。显微镜下随机取10个高倍视野拍照并进行结果判定。

5统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示。多组计量资料间的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用Dunnett-t检验，采用2检验分析ACTL8的表达与临床变量关系，采用log-rank检验分析ACTL8的表达与总生存期关系，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1ACTL8蛋白在乳腺癌细胞株中和乳腺癌组织中的表达

为了研究ACTL8蛋白在乳腺癌中的表达情况，我们选择1种正常的乳腺上皮细胞株和5种乳腺癌细胞株。结果显示，正常乳腺上皮细胞株MCF-10A基本无ACTL8蛋白的表达，而乳腺癌细胞T47D、BT474、SKBR3和HCC1954中的ACTL8蛋白显著表达,见图1。

Figure 1.The expression of ACTL8 in the normal epithelial cell line and breast cancer cell lines tested by Western blot. β-tubulin was used as an internal control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsMCF-10A group.

图1Western blot检测正常乳腺上皮细胞株及乳腺癌细胞株中ACTL8蛋白的表达

为了验证ACTL8蛋白在临床肿瘤样本中的表达量是否和细胞株水平上结果一致，我们收集了6例乳腺癌石蜡标本及其对应的癌旁组织标本进行免疫组织化学染色。结果显示，在6例乳腺癌组织样本的细胞胞浆中均可见到ACTL8阳性染色，呈棕黄色，而在癌旁组织的细胞胞浆中未见到明显的阳性染色，见图2。这表明ACTL8蛋白在乳腺癌组织中的表达量明显高于癌旁乳腺导管上皮细胞，该结果与乳腺癌细胞株的蛋白表达结果一致。

2ACTL8的mRNA表达与乳腺癌临床病理特征的关系

由于ACTL8蛋白在乳腺癌细胞中的表达显著高于正常上皮细胞，这提示ACTL8的表达可能与临床病理特征或预后有关。为了验证这一点，我们收集了TCGA乳腺癌数据集，将488例标本纳入分析，其中61例为正常乳腺组织标本，427例为乳腺癌组织样本，分析了ACTL8的mRNA表达水平与乳腺癌临床病理特征的关系。结果显示，ACTL8的mRNA在乳腺癌组织中的表达量显著高于正常乳腺组织(P<0.05)，见图3。ACTL8的mRNA表达水平与乳腺癌患者年龄、肿瘤大小、临床TNM分期和淋巴结转移相关(P<0.05)，即年龄越小(<65岁)、肿瘤直径越大(≥2 cm)、TNM分期越晚(II+III+IV)、淋巴结有转移，ACTL8的mRNA阳性表达率越高,见表1。

Figure 2.The expression levels of ACTL8 between breast cancer specimens and corresponding adjacent breast tissues (immunohistochemical staining, ×200).A: negative expression of ACTL8 in adjacent breast tissue; B: positive expression of ACTL8 in breast cancer tissue.

图2ACTL8 在乳腺癌组织中及对应癌旁组织中的表达

Figure 3.The mRNA expression levels of ACTL8 between the breast cancer tissues and the normal breast tissues. Mean±SD.*P<0.05vsnormal breast tissues.

图3ACTL8 mRNA在乳腺癌样本中及正常乳腺组织的表达

3ACTL8的mRNA表达与乳腺癌预后的关系

生存分析结果显示，ACTL8的mRNA表达水平与乳腺癌患者术后生存期相关，高表达者总体生存率低。低表达和高表达的乳腺癌病人5年内累计生存率分别为92.7%和78.6%，见图4。

讨论

乳腺癌是女性中发病率最高的肿瘤，发病率和死亡率正呈逐年上升势头，乳腺癌患者也呈现年轻化趋势。寻找新的预后标志物对预防乳腺癌的复发和转移及改善患者预后具有非常重要的意义[9-10]。

目前，已经有153个CT-X基因被报道[11]，而且这些基因在不同的肿瘤细胞中的表达量不同，CT的表达量增高提示着疾病的进展以及不良的预后[12-13]。基于CT-X基因严格的表达及其与肿瘤免疫的关系，免疫疫苗的研究和应用受到重视，比如MAGEA和NY-ESO-1/CTAG1B疫苗已经应用于临床试验，包括肺癌和黑色素瘤的病人[14-15]。ACTL4的单克隆抗体Ipilimumab已经应用于临床多中心实验研究阶段，药物的持续效应还有待于观察研究[16]。ACTL8为CTA家族成员之一，其在肿瘤中的相关研究较少。Freitas等[17]通过对胶质瘤病人的研究发现ACTL8、OIP5、XAGE3和CTCFL 4种CTA蛋白在恶性胶质瘤中高表达，但ACTL8与病人生存期无关。由于该研究仅纳入48例胶质瘤病人，而又无ACTL8在其它肿瘤中的相关研究，因此ACTL8与肿瘤发生发展及预后的关系尚不明确。

表1在427例乳腺癌样本中ACTL8的mRNA表达量与临床病理特征的关系

Table 1.The correlation between the mRNA expression of ACTL8 and the clinicopathological features in the 427 cases of breast cancer

Figure 4.Kaplan-Meier survival curves for the patients with breast cancer according to the mRNA expression of ACTL8, which was checked by the log-rank test (P<0.01).

图4ACTL8 mRNA的表达量与生存期的关系

本研究发现ACTL8蛋白在乳腺癌细胞株中的表达量明显高于正常的乳腺上皮细胞株，且此实验结果在临床乳腺癌样本中得到验证，即ACTL8蛋白在乳腺癌肿瘤样本中的表达量显著高于相应的癌旁组织。为了深入探讨分析ACTL8与乳腺癌的临床病理和预后的关系，本研究利用Oncomine中TCGA乳腺癌数据集的资料系统地分析了ACTL8 mRNA表达与乳腺癌临床病理特征及预后的关系。结果显示，ACTL8的mRNA表达与乳腺癌患者年龄、肿瘤大小、临床TNM分期和淋巴结转移相关，且ACTL8的mRNA表达量越高，预后越差。这些结果提示ACTL8可作为判断乳腺癌预后的标志物，对评估患者预后具有一定的指导意义。而ACTL8在乳腺癌发生、发展和转移的功能分子机制还有待进一步深入研究。

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(责任编辑： 卢萍， 罗森)

ACTL8 expression and its correlation with clinicopathological features and prognosis in breast cancer

HE Li-cai, ZHU Zhen-feng, ZHENG Qian-qian, CHEN Shang, GU Hai-hua

(SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China.E-mail:haihuagu@gmail.com)

[KEY WORDS]Breast cancer; Actin-like protein 8; Clinicopathological features; Prognosis

[ABSTRACT]AIM: To investigate the actin-like protein 8 (ACTL8) expression and its relationship with clinicopathological features and prognosis in breast cancer.METHODS: The expression of ACTL8 in human normal mammary epithelial cell line MCF-10A and 5 breast cancer cell lines was detected by Western blot. The expression of ACTL8 was also investigated by immunohistochemistry in 6 cases of breast cancer specimens with adjacent normal tissues. The data in 488 cases of breast specimens from TCGA dataset were downloaded, and the relationship between the mRNA expression of ACTL8 and the clinicopathological features and prognosis was analyzed.RESULTS: The expression of ACTL8 in 4 breast cancer cell lines was significantly higher than that in breast epithelial cell line MCF-10A.The level of the ACTL8 expression in breast tumors was significantly higher than that in the corresponding adjacent normal breast tissues. The mRNA expression of ACTL8 was correlated with age, tumor size, clinical TNM stage and lymph node metastasis of breast cancer patients (P<0.05). The high expression level of ACTL8 mRNA indicated a poor prognosis of breast cancer patients. CONCLUSION: ACTL8 protein is highly expressed in breast cancer specimens and is closely correlated with the clinicopathological features and prognosis, suggesting that ACTL8 is a prognostic marker for breast cancer or a potential new target for treatment of breast cancer.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 1138- 05

[收稿日期]2016- 01- 22[修回日期] 2016- 03- 28

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81400125; No. 81372826)；浙江省自然科学基金资助项目(No. LQ13H080002)；教育部博士点新教师类资助项目(No. 20133321120003)

通讯作者△Tel: 0577-86699659； E-mail: haihuagu@gmail.com

[中图分类号]R737.9; R363

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.030