通心络对新西兰兔动脉粥样硬化血小板活化的影响*

刘红利，　李红蓉，　尹玉洁，　位　庚，　常成成，　王宏涛

[1南京中医药大学，江苏 南京 210029；2河北医科大学，3国家中医药管理局重点研究室(心脑血管络病)，4河北省络病重点实验室，5河北以岭医药研究院，河北 石家庄 050035]



·短篇论著·

通心络对新西兰兔动脉粥样硬化血小板活化的影响*

刘红利1，李红蓉2，尹玉洁2，位庚2，常成成4,5，王宏涛3,4△

[1南京中医药大学，江苏 南京 210029；2河北医科大学，3国家中医药管理局重点研究室(心脑血管络病)，4河北省络病重点实验室，5河北以岭医药研究院，河北 石家庄 050035]

[摘要]目的： 探讨通心络对动脉粥样硬化新西兰兔血小板的保护作用。方法: SPF 级新西兰家兔 42 只，雌雄各半，随机分为7 组：正常组,模型组,通心络超微粉低、中、高剂量组(0.15、0.3和0.6 g·kg-1·d-1)，阿托伐他汀组(2.5 mg·kg-1·d-1),阿司匹林组(12.5 mg·kg-1·d-1)。正常组给予普通饲料12周，模型组给予高脂饮食12周建立动脉粥样硬化模型，其余各组在给予高脂饲料的同时按剂量连续灌胃给药12周，饮水不限。末次给药后禁食12 h取材。取全血进行血常规检测，取血清、血浆分别进行血脂水平、血小板因子4(PF4)和可溶性CD62P(sCD62P)检测，流式细胞术检测血小板钙离子，电镜观察血小板超微结构，光镜下进行动脉粥样组织病理学观察。结果: 与正常组比较，模型组新西兰兔血小板计数及血小板平均体积明显增加，血脂胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平显著增高，血清PF4、sCD62P及血小板钙离子浓度表达明显增加(P<0.05)。与模型组相比，各用药组均不同程度地降低血小板计数和血小板平均体积，血小板表达PF4、sCD62P水平及血小板内钙离子浓度明显降低，通心络低、中、高剂量组和阿托伐他汀组降低血清TC、TG和 LDL-C水平(P<0.05)；电镜观察见正常组血小板形态规则，细胞器分布均匀，模型组血小板形态畸形，伪足明显，α颗粒及致密颗粒减少，胞浆内空泡增多，提示血小板活化状态，用药组均不同程度改善血小板形态，增加α颗粒及致密颗粒数量，胞质损伤减轻。组织病理学观察正常组内膜光滑完整，模型组内膜显著增厚，泡沫细胞大量聚集，斑块形成，用药组通心络高剂量组内膜增厚显著降低，泡沫细胞明显减少，斑块形成不明显，其它用药组均不同程度改善内膜增厚，降低泡沫细胞含量。结论: 通心络可显著抑制动脉粥样硬化过程中血小板的活化状态，对于延缓动脉粥样硬化血栓形成具有重要临床治疗价值。

[关键词]动脉粥样硬化； 血小板； 通心络

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病的重要病理生理基础，其干扰因素众多，涉及血小板、单核/巨噬细胞、内皮细胞，炎症、免疫、氧化等多种细胞、多个病理环节，已经成为当今社会影响人类健康的“第一杀手”。其中，血小板是血液中没有细胞核的细胞碎片，主要参与生理病理性止血和血管损伤修复。研究也发现，血小板活化参与到许多炎症相关疾病如动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病、高血压、中风等的发病过程中[1]，基于气血相关理论和西医还原论思维，吴以岭院士系统提出脉络-血管系统病概念，将发生在血管病变的动脉粥样硬化类疾病归属于脉络病变范畴，并提出脉络瘀阻是动脉粥样硬化发生发展的重要病程阶段。通心络胶囊是基于脉络学说“络以通为用”的治疗原则研制出的对于心脑血管疾病具有血液、血管、组织三重保护作用的有效方剂[2]，临床及实验研究均证实通心络具有显著疗效。本文通过高脂饮食建立动脉粥样硬化模型观察通心络对动脉粥样硬化过程中血小板活化的抑制作用，为通心络在心脑血管疾病中的运用进一步提供理论支持。

材料和方法

SPF 级新西兰兔，(1.5±2.0) kg，雌雄各半，购于北京富豪动物养殖中心，合格证号为SCXK(京)2010-0010。所有动物饲养于河北省中西医结合医药研究院新药评价中心。

2药物、试剂及仪器

通心络药粉由石家庄以岭药业股份有限公司提供；阿托伐他汀钙片(辉瑞制药有限公司)；阿司匹林肠溶片(石家庄制药集团欧意药业有限公司)。

总胆固醇(total cholesterol，TC)试剂盒，低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)试剂盒，甘油三酯(triglyceride，TG)试剂盒(北京九强生物有限公司)；血小板因子4(platelet factor 4，PF4)ELISA试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司)；可溶性CD62P(soluble CD62P，sCD62P)ELISA试剂盒(上海高创化学科技公司)；Fluo-3AM荧光探针(Biotium)，用二甲基亚砜溶解；高脂饲料(胆固醇1%,蛋黄粉7.5%，猪油 5%,基础饲料86.5%)由北京富豪动物养殖中心加工配制；XD71型酶标仪(上海迅达医疗仪器公司)；7080全自动生化分析仪、JEM-1400透射电子显微镜(HITACHI)；Sysmex XE-5000全自动血细胞分析仪；Biofuge Primo型高速冷冻离心机(索富达公司)； UC-7型超薄切片机、DM6000B型全自动生物显微镜(Leica)； Spertra Max M2多功能酶标仪(Molecular Devices)。

3实验方法

3.1造模及给药新西兰兔适应性喂养3 d后随机分为正常组、模型组、通心络低、中、高剂量组、阿托伐他汀组、阿司匹林组共 7组，每组6只。正常组给予普通饲料; 模型组予高脂饲料，其余各组在喂饲高脂饲料的同时给予相应药物灌胃干预，通心络低、中、高剂量组分别为0.15、0.3和0.6 g·kg-1·d-1，阿托伐他汀组2.5 mg·kg-1·d-1，阿司匹林组12.5 mg·kg-1·d-1，实验前用0.5%羧甲基纤维素钠溶液溶解配制相应工作液，灌胃量3 mL/kg，各组饮水不限，实验周期为12周。12周末留取血液和组织标本待测。

3.2血小板计数、血小板平均体积及血脂水平测定末次给药后禁食12 h取材，1%异戊巴比妥纳耳缘静脉注射麻醉，腹主动脉采血，全血立即采用全自动血细胞分析仪检测血小板计数及血小板平均体积。剩余全血室温静置2 h，3 000 r/min 离心 15 min 分离制备血清及血浆。血清采用自动生化分析仪测定 TC、TG及LDL-C。

伴随着经济全球化进程不断加快，在信息化浪潮席卷全球的背景下，信息化对于一个企业，其重要性不言而喻。面对日益激烈的市场竞争，越来越多的企业开始意识到，在互联网技术飞速发展的今天，企业的发展必须依托信息技术，特别是在信息技术应用相对滞后的建筑业中。住房和城乡建设部印发的《2016-2020年建筑业信息化发展纲要》指出，“十三五”期间，要全面提高建筑业信息化水平，形成一批具有较强信息技术创新能力和信息化应用达到国际先进水平的建筑企业及具有关键自主知识产权的建筑业信息技术企业，人力资源管理信息化作为建筑业信息化重要一环被写进纲要中。

3.3主动脉壁内膜病理观察12周末处死动物，取从心脏升主动开始至髂主动脉分叉口结束，剥离外膜脂肪组织，4%甲醛固定，取主动脉弓约2 cm处，常规石蜡包埋，制成4 μm厚横断面切片，行苏木精-伊红(HE)染色光镜下观察动脉内膜组织病理改变。

3.4PF4和sCD62P的检测取各组血清和血浆采用酶联免疫吸附法分别进行PF4和sCD62P含量检测，操作步骤严格按照试剂说明书进行。

3.5血小板钙离子浓度检测枸橼酸钠抗凝管收集全血，立即室温下800 r/min 离心10 min获取上层富血小板血浆，调整血小板计数为3×1011/L，加入Fluo-3 AM使其终浓度为10 μmol/L，37 ℃ 孵育30 min，在流式细胞仪上用激发波长488 nm，测定血小板Fluo-3的平均荧光强度反映血小板Ca2+水平。

3.6血小板的电镜观察各组随机选取1只，按上法制备富血小板血浆，加入等体积的0.2%戊二醛预固定30 min。预固定后，再次3 000 r/min离心10 min离心弃去上层清液，留取沉淀转移至1.5 mL EP管中加满2.5%戊二醛4 ℃固定24 h，经1%锇酸、乙醇梯度脱水，环氧树脂包埋处理, 进行超薄切片，铀铅双染色，在JEM-1400透射电子显微镜下观察血小板超微结构。

4统计学处理

数据采用统计软件 SPSS 19.0对实验数据进行分析，实验结果以均数±标准差(mean±SD)表示。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，各组均数间两两比较采用Bonferroni校正的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1不同组间血脂水平、血小板计数和血小板平均体积比较

如表1所示，12周末，与正常组比较，模型组血清TG、TC和LDL-C水平显著增高(P<0.01)，且血小板计数增多，血小板平均体积增大；与模型组比较，通心络低、中、高剂量组、阿托伐他汀组均能显著降低TG、TC和LDL-C水平(P<0.01)，同时降低血小板数量，减小血小板平均体积(P<0.05)。阿司匹林组亦可降低血小板数量，减小血小板平均体积(P<0.01)，见表2。

表1不同组间血脂水平的比较

Table 1.The blood lipid levels in different groups (mmol/L. Mean±SD.n=6)

N: normal group; M: model group; TXL-L: low dose of Tongxinluo group; TXL-M: medium dose of Tongxinluo group; TXL-H: high dose of Tongxinluo group; ATO: atorvastatin group.**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsmodel group.

**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

2各组动脉内膜病理学观察比较

正常对照组内膜结构完整，内皮表面光滑，未发现内皮下脂质沉积及泡沫细胞浸润，平滑肌排列整齐。模型组可见明显内膜增厚，脂质沉积、泡沫细胞形成，脂质斑块隆起突向管腔，管腔明显狭窄，中膜平滑肌排列紊乱，弹力纤维变薄。与模型组比较，各用药组内膜增厚不同程度减轻，脂质沉积改善，斑块内泡沫细胞减少，其中以通心络高剂组和阿托伐他汀组内膜改善最显著，内膜结构相对完整，见图1。

Figure 1.The appearance of carotid artery morphology in different groups (HE staining, ×400).

图1不同组间主动脉内膜病理改变

3不同组间表达PF4和sCD62P比较

如表2所示，12周末，与正常组比较，模型组血小板分泌到血清和血浆中的PF4和sCD62P显著增多(P<0.01)；用药组与模型组比较，各用药组均能显著降低PF4的表达(P<0.01)，除通心络低剂量组，其余各用药组sCD62P表达明显降低(P<0.01)。提示各用药组对血小板的释放功能均有抑制作用。

4各组间血小板Ca2+浓度的比较

12周末，与正常组比较，模型组血小板内钙离子显著增高(P<0.01)；用药组与模型组比较，除通心络低剂量组外，其余各组血小板Ca2+均有不同程度降低(P<0.01)，见图2。

Figure 2.The changes of platelet calcium ion in different groups. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

图2不同组间血小板钙离子浓度比较

5各组血小板超微结构的比较

正常组血小板形状多呈圆形或椭圆形，表面光滑，伪足伸出不多见，胞浆内α颗粒和致密颗粒数量较多分布均匀，结构相对完整清晰。模型组血小板形态畸形，大量伪足伸出，血小板间可见聚集成片，胞浆内α颗粒和致密颗粒数量减少，空泡增多，胞质损伤明显。与模型组比较，各用药组均可在一定程度上改善血小板形态，增加胞浆内细胞器颗粒数量，颗粒分布较均匀，见图3。

讨论

Figure 3.The changes of platelet ultrustructures in different groups observed under electron microscope.

图3不同组间血小板超微结构的改变

动脉粥样硬化传统危险因素如吸烟、高血糖等，以及血流剪切力、内皮细胞损伤均可激活血小板，诱导血小板发生形态和功能改变。血小板参数的增大是血小板活化的指标，血小板平均体积增加，是血小板功能亢进的重要指标[12]。血小板内散在分布有α颗粒和致密颗粒，α颗粒含有大量纤维蛋白原、组织蛋白酶等，在血小板活化后释放出大量活性物质，其中CD62P是α颗粒膜糖蛋白，属于选择素家族黏附分子，是血小板活化的敏感指标，通过介导与内皮细胞的黏附作用启动血栓形成[13]。PF4也是储存在血小板α颗粒中的特异蛋白之一，当血小板活化后可释放到血浆中，其浓度与AS病变分级、临床症状等临床参数呈正相关。Sachais等[14]证实敲除ApoE-/-小鼠的PF4基因后，动脉粥样硬化的病变面积显著减小，PF4还可通过NF-κB、Toll受体等信号通路上调巨噬细胞基质金属蛋白酶9的表达，影响斑块的稳定性[15]。血小板胞浆内钙离子浓度升高也是血小板活化的主要标志物，参与到血小板聚集、黏附、释放等过程中，并为血小板收缩、变形提供能量，促进细胞膜融合，伪足伸出。有研究发现，当钙离子浓度在一定范围内时，血小板聚集率与钙离子浓度呈明显正相关，血小板达最大聚集率时间也明显缩短[16]。

基于复杂性科学思维与中医整体、系统、辩证、恒动思维相结合，络病理论提出脉络-血管系统同一性，将脉作为独立的实体脏器进行研究，对于血管病变的共性发病规律与病理机制和治疗突显了其整体优势[17]。动脉粥样硬化病变部位在脉，其发病缓慢、病程缠绵，“久病入络”，归属于脉络病变范畴。通心络胶囊是络病理论指导下的通络复方中药代表方，由人参、降香、水蛭、全蝎、蜈蚣、土鳖虫、蝉蜕、冰片等组成，针对脉络-血管系统病的共性病理环节，即络气虚滞/郁滞、脉络瘀阻、脉络绌急、脉络瘀塞[18]，具有益气活血、搜风通络功效。临床与实验基础研究显示，通心络具有降脂、抗炎、保护内皮细胞、稳定易损斑块等多重作用，被Am J Physiol Heart Circ Physiol点评称“本研究为未来可能发展成冠心病事件的高危患者点燃了希望之灯”[19]。抗血小板治疗是治疗血栓疾病的基石，对于心脑血管病的发病率和死亡率具有显著的降低作用[20]，阿司匹林是常用的抗血小板药物，然而有部分患者存在阿司匹林抵抗现象，不能有效抑制血小板活化，仍有发生心血管事件的可能性。尹承华等[21]临床观察通心络胶囊对阿司匹林抵抗患者血小板聚集功能的影响中发现单独使用通心络胶囊或通心络胶囊与阿司匹林联合使用均可降低COL和ADP诱导的血小板聚集率，改善阿司匹林抵抗现象。通心络还可抑制急性冠脉综合症患者接受介入治疗后的血小板活化表达的CD62P、CD63、GPⅡb/Ⅲa、vWF因子，保护血管内皮细胞[22]

本文实验采用高脂饮食建立动脉粥样硬化模型，予通心络干预治疗。通心络低、中、高剂量组均可在不同程度上降低动脉粥样硬化TC、TG和LDL-C水平，改善内膜增厚程度，减少泡沫细胞浸润，减轻动脉粥样硬化病变。此外，通心络不仅改善血小板形态，增加血小板颗粒数量，同时还可通过降低血小板数量、血小板平均体积，抑制血小板活化表达的PF4和sCD62P，同时降低血小板内钙离子浓度，保护血小板功能。该研究进一步阐明通心络发挥抗动脉粥样硬化的保护机制作用，为中医络病理论指导动脉粥样硬化类疾病防治提供支持，同时也应更加深入探讨其发挥保护血小板作用的分子机制。

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(责任编辑： 卢萍， 罗森)

Effects of Tongxinluo on activation of platelet in rabbit model of atherosclerosis

LIU Hong-li1, LI Hong-rong2, YIN Yu-jie2, WEI Geng2, CHANG Cheng-cheng4, 5, WANG Hong-tao3, 4

[1NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210029,China;2HebeiMedicalUniversity，3KeyResearchCentreofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine(CollateralDiseaseofCardiovascular),4KeyLaboratoryofCollateralDiseaseofHebeiProvince,5HebeiYilingMedicalResearchInstitute,Shijiazhuang050035,China.E-mail:wht72007@126.com]

[KEY WORDS]Atherosclerosis; Platelet; Tongxinluo

[ABSTRACT]AIM: To study the effects of Tongxinluo on the activation of platelets in a rabbit model of atherosclerosis. METHODS: New Zealand rabbits were randomly divided into 7 groups: normal group, model group, the groups treated with high, medium and low doses of Tongxinluo micropowder (0.15， 0.3 and 0.6 g·kg-1·d-1), atorvastatin group (2.5 mg·kg-1·d-1), and aspirin group (12.5 mg·kg-1·d-1). The rabbits in normal group was fed with common diet for 12 weeks, and the rabbits in model group were fed with high-fat diet for 12 weeks to establish atherosclerosis model. The rabbits in the rest groups were treated with the corresponding drugs, at the same time to give high-fat diet. Fasting for 12 h after the last treatment, whole blood was collected to perform the blood routine test, and to measure serum and plasma levels of lipids, platelet factor 4 (PF4) and soluble CD62P (sCD62P). Flow cytometry was used to analyze platelet calcium ion concentration. Electron microscopy was used for platelet superfine observations, and light microscopy for observing the pathological changes. RESULTS: Compared with normal group, the levels of triglyceride (TG), total cholesterol (TC), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), platelet counts, and mean platelet volume in model group were significantly elevated, and the levels of PF4, sCD62P and calcium were also significantly increased (P<0.05). Compared with model group, except aspirin group, the levels of TG, TC and LDL-C in high, medium and low doses of Tongxinluo groups and atorvastatin group were effectively decreased. The platelet counts and mean platelet volume in all treatment groups were markedly decreased, and the serum levels of PF4, sCD62P and Ca2+in platelet (P<0.05) were reduced. In electron microscopic observation, the shape of platelet was regular and organelles distributed uniform in normal group. However, in model group, the shape of platelet was irregular, pseudopodia forming was obviously observed, and α particles and dense granules decreased, indicating that the platelet was activated. To a different extent, the platelet shape, increase in the number of α particles and dense granules were improved in treatment groups and the damage of the cytoplasm was attenuated. Through histopathological observation, the intimal was smooth and complete in normal group. In the model group, the intimal thickness markedly increased, foam cell aggregated, and plaque was formed. Compared with model group, the intimal thickening and the number of foam cells were significantly decreased, and plaque formation was not obvious in atorvastatin group and high dose of Tongxinluo group. The pathological damages in the other treatment groups were alleviated in different degrees. CONCLUSION: Tongxinluo significantly inhibits the activation of platelets in the process of atherosclerosis, and has important clinical value to delay the atherosclerotic thrombosis.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 1106- 06

[收稿日期]2015- 10- 26[修回日期] 2016- 04- 01

*[基金项目]国家重点基础研究发展计划(973计划)(No. 2012CB518606)

通讯作者△Tel: 0311-85901553; E-mail: wht72007@126.com

[中图分类号]R543; R363.2

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.024