PI3K/AKT信号通路在SjCystatin诱导M2巨噬细胞分化过程中的影响*

刘　炬，　杨　潇，　岳　媛，　王乐旬，　吴钟凯

(中山大学附属第一医院心外二科，广东 广州 510080)



▲并列第1作者

PI3K/AKT信号通路在SjCystatin诱导M2巨噬细胞分化过程中的影响*

刘炬▲，杨潇▲，岳媛，王乐旬，吴钟凯△

(中山大学附属第一医院心外二科，广东 广州 510080)

[摘要]目的： 进一步确定日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(SjCystatin)诱导M2巨噬细胞分化的亚型及相关机制。方法: 用ELISA、RT-qPCR或Western blot法测定IL-10、IL-12、巨噬细胞亚型表面标志物LIGHT(M2b)及Arg-1(M2a+M2c)的表达；用Western blot法测定AKT的磷酸化水平。结果: SjCystatin处理组在6 h、12 h和24 h时IL-10表达量持续增加；处理12 h， LIGHT的mRNA和蛋白表达量增加但Arg-1的mRNA和蛋白表达量降低；AKT磷酸化水平增加。PI3K/AKT抑制剂处理组IL-10的释放量在12 h和24 h持续降低；24 h， LIGHT的mRNA和蛋白表达量降低但Arg-1的mRNA和蛋白表达量增加；AKT的磷酸化水平减少。结论: SjCystatin 促进了活化的M2巨噬细胞分化为M2b亚型巨噬细胞，并且PI3K/AKT信号通路参与了这一过程。

[关键词]半胱氨酸蛋白酶抑制剂； M2b巨噬细胞； M2巨噬细胞； PI3K/AKT信号通路

巨噬细胞极化(macrophage polarization)/分化是单核巨噬细胞系统的重要特点，根据其分化后诱导免疫反应的类型不同，可将分化后的巨噬细胞分为M1和M2型巨噬细胞[1]。M2型巨噬细胞又可根据其表面分子标志物和功能进一步分为M2a、M2b和M2c[2]3种，它们在炎症调控过程中发挥着重要的作用。

众所周知，寄生虫体内的半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)是一种重要的免疫调节分子，巨噬细胞是它们众多靶向细胞中的一员[3]。研究表明cystatin具有良好的抗炎作用[4]。本实验中所应用的cystatin蛋白——SjCystatin为通过体外重组表达的日本血吸虫(Schistosomajaponicum)体内的免疫调节分子[5]。

已有研究表明cystatin对巨噬细胞有诱导分化作用，并且经cystatin诱导分化产生的巨噬细胞是M2型巨噬细胞，后者产生了大量的IL-10，可有效缓解急性炎症的反应程度[4]。我们的前期实验研究也证实参与炎症反应的巨噬细胞在受到SjCystatin诱导后可以分化成为M2巨噬细胞，且伴有大量的IL-10生成，但是经SjCystatin诱导后M2巨噬细胞分化为何种亚型及相关机制尚不明确[5]。本研究我们将尝试进一步阐明M2巨噬细胞分化的亚型及它们之间的相互作用机制。

材料和方法

1巨噬细胞细胞来源和SjCystatin获取、鉴定

SjCystatin的获取、鉴定和前期实验方法相同[5]。RAW264.7 巨噬细胞选自于中山大学寄生虫研究室。

2主要试剂

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS;E.coliO55:B5)购于Sigma；澳洲胎牛血清和高糖DMEM选购于Gibco；PI3K/AKT抑制剂LY294002购于Cell Signaling Technologies；IL-10和IL-12酶联免疫吸附试验试剂盒选购于Bioscience; CCK-8试剂盒购于上海优选生物科技有限公司； RT-qPCR试剂盒购于TaKaRa；免疫印迹试剂盒等选购于碧云天生物技术研究所。

3方法

3.1细胞培养和活力测试将RAW264.7细胞饲养在含10%胎牛血清和DMEM的25 mm2塑料培养瓶中，于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育12 h。采用CCK-8法测定细胞存活率。将RAW264.7细胞接种于96孔板中，接种密度为5×105/cm2，然后用SjCystatin(2.5 mmol/L)和PI3K/AKT抑制剂LY294002共同孵育24 h。每孔中加入20 μL CCK-8(10%)孵育1 h后，收集上清液，并在450 nm处用酶标仪测量吸光度(A)，评价细胞存活率。

3.2细胞培养、分组、干预和收集将RAW264.7细胞饲养在含10%胎牛血清和DMEM的25 mm2塑料培养瓶中，于5%CO2、 37 ℃培养箱内培养12 h 后弃培养基,将细胞分为4组(对照组、LPS组、LPS+SjCystatin组和LPS+SjCystatin+LY294002组)，接种于6孔板中，接种密度为5×105/cm2，分别向无血清培养基中加入10 mg/L SjCystatin、1 mg/L LPS和(或)10 μmol/L PI3K/AKT抑制剂LY294002,继续培养。经4 h、6 h、12 h和24 h刺激后分别收取细胞和上清。

3.3ELISA测定上清细胞因子的含量分别参照小鼠ELISA试剂盒操作说明书步骤处理标本，在酶标仪中450 nm处测量A值，绘制标准曲线，在标准曲线上找到各吸光度所对应的上清中IL-10和IL-12的含量。

3.4提取RNA和双杂交探针实时荧光定量PCR法检测细胞表面标志物的表达量应用TRIzol RNA提取液后，按照氯仿-异丙醇法提取细胞总RNA后根据TaKaRa染料法实时荧光定量试剂盒说明书操作步骤进行双杂交探针实时荧光定量PCR。PCR在Roche Cycler 480系统进行。PCR反应条件为95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s(45个循环)。引物序列见表1，由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成。

F: forward; R: reverse.

3.5裂解巨噬细胞和Western blot法检测p-AKT的蛋白水平按照细胞全蛋白抽提试剂盒说明书提取细胞总蛋白。冰PBS清洗2次，弃去PBS，按照说明加入蛋白裂解液。冰浴条件下进行匀浆，4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，离心半径15 cm，去除沉淀，留取上清。按照蛋白定量测试盒说明书测定各组蛋白浓度制备5%浓缩胶和10%分离胶，每孔上样量为70 μg，进行SDS-PAGE，转膜并加入I抗，4 ℃过夜，次日PBST洗膜5 min 4次，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG II抗，按1∶5 000稀释，室温孵育1～2 h，PBST洗膜5 min 5次。ECL显色，胶片扫描后用Quantity One软件分析灰度值，并计算比值后比较差异性。

4统计学处理

应用SPSS 15.0数据分析软件进行统计学分析，数据采用均数±标准差 (mean±SD)表示，两组间差异比较采用t检验，多组间差异比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1SjCystatin诱导M2巨噬细胞分化为M2b亚型巨噬细胞

1.1SjCystatin诱导M2巨噬细胞分化后细胞因子含量的变化如图1所示， SjCystatin处理组的IL-10的含量随时间变化持续上升，并在24-h达到高峰，和LPS处理组相比较，两者间差异有统计学显著性(P<0.05)；和LPS处理组相比较，SjCystatin处理组中IL-12/IL-10比值在所有时间点均偏小，并且在6 h时最小，差异有统计学显著性(P<0.05)。

Figure 1.The release of IL-10 (A) and the ratio of IL-12/IL-10 (B) in polarized M2 macrophages induced by SjCystatin.Mean±SD.n=4.*P<0.05vsLPS.

图1SjCystatin诱导M2巨噬细胞极化后IL-10含量的变化

1.2SjCystatin诱导M2巨噬细胞分化后细胞表面标志物及细胞因子mRNA表达量的变化由图2可见，在SjCystatin作用下，RT-qPCR结果显示IL-10、IL-12的mRNA表达量随时间变化有增加趋势，但IL-12的mRNA表达量均小于同时点IL-10的mRNA表达量；经过12 h刺激后，和LPS处理组相比较，SjCystatin处理组中LIGHT的mRNA表达量增加明显(P<0.05)；SjCystatin处理组中Arg-1的mRNA表达量在12 h时较LPS处理组减少(P<0.05)，但在24 h时Sjcystatin处理组中Arg-1的mRNA表达量较LPS处理组明显增加(P<0.01)，但表达量仍小于同时点LIGHT的mRNA表达量。

Figure 2.The mRNA expression in polarized M2 macrophages induced by SjCystatin.Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsLPS.

图2SjCystatin诱导M2巨噬细胞极化后mRNA表达量的变化

由图3、4可见，在12 h时，和LPS处理组相比，SjCystatin处理组LIGHT蛋白水平明显增加(P<0.05),而Arg-1蛋白水平却明显减少(P<0.05)。

Figure 3.The effect of SjCystatin on M2 macrophage differentiation tested by examining the expression of LIGHT. After treatment with LPS and SjCystatin for 12 h, the cells were harvested and cell lysates were subject to Western blot assay.Mean±SD.n=4.*P<0.05vsLPS.

图3SjCystatin诱导M2亚型巨噬细胞极化后LIGHT蛋白水平的变化

Figure 4.The effect of SjCystatin on M2 macrophage differentiation tested by examining the expression of Arg-1. After treatment with LPS and SjCystatin for 12 h, the cells were harvested and cell lysates were subject to Wes-tern blot assay.Mean±SD.n=4.*P<0.05vsLPS.

图4SjCystatin 诱导M2亚型巨噬细胞极化后Arg-1蛋白水平的变化

1.3SjCystatin诱导M2巨噬细胞分化后AKT磷酸化水平的变化Western blot实验结果显示，LPS处理组有少量p-AKT，经过SjCystatin刺激后，其蛋白水平较LPS处理组明显增加，且两者间差异有统计学显著性(P<0.05)，见图5。

Figure 5.The protein level of p-AKT in polarized M2 macrophages induced by SjCystatin.Mean±SD.n=4.*P<0.05vsLPS.

图5SjCystatin诱导M2巨噬细胞极化后p-AKT水平的变化

2PI3K/AKT 信号通路对 SjCystatin诱导的M2巨噬细胞中细胞因子表达量的影响

2.1PI3K/AKT 信号通路抑制剂对 SjCystatin诱导的M2巨噬细胞中细胞因子含量的影响如图6所示，SjCystatin处理组的RAW264.7 巨噬细胞经PI3K/AKT 信号通路抑制剂 LY294002干预后，其IL-10含量在12 h和24 h均较干预前下降。

Figure 6.The effect of PI3K/AKT signaling pathway inhibitor on the release of IL-10 in polarized M2 macrophages induced by SjCystatin. Mean±SD.n=4.

图6PI3K/AKT 信号通路抑制剂对 SjCystatin诱导M2巨噬细胞极化后IL-10含量的影响

2.2PI3K/AKT 信号通路抑制剂对 SjCystatin诱导的M2巨噬细胞中细胞表面标志物和细胞因子mRNA表达量的变化PCR实验结果显示，SjCystatin处理组的RAW264.7 巨噬细胞经PI3K/AKT 信号通路抑制剂 LY294002干预后，IL-10的mRNA表达量在12 h和24 h均较干预前略有下降，但差异不显著；在抑制剂干预后12 h和24 h，和SjCystatin处理组相比较，干预组LIGHT的mRNA表达量均呈下降趋势，且24 h最为明显(P<0.05)； 而干预组Arg-1的mRNA表达量则在24 h明显增加(P<0.05)。

Figure 7.The effect of PI3K/AKT signaling pathway inhibitor on the expression of mRNA.Mean±SD.n=4.*P<0.05vsLPS+SjCystatin.

图7PI3K/AKT信号通路抑制剂对SjCystatin诱导M2巨噬细胞极化后mRNA表达量的影响

由图8、9可见，在24 h 时，和LPS+SjCystatin处理组相比，LPS+SjCystatin+LY294002处理组LIGHT蛋白水平明显减少(P<0.05),而Arg-1蛋白水平虽略有增加，但差异没有统计学显著性。

Figure 8.The effect of PI3K/AKT signaling pathway inhibitor on M2 macrophage differentiation tested by examining the expression of LIGHT. After treatment with LPS and SjCystatin for 24 h, the cells were harvested and cell lysates were subject to Western blot.Mean±SD.n=4.*P<0.05vsLPS+SjCystatin.

图8PI3K/AKT 信号通路抑制剂对 SjCystatin诱导M2巨噬细胞极化后LIGHT蛋白水平的影响

Figure 9.The effect of PI3K/AKT signaling pathway inhibitor on M2 macrophage differentiation tested by examining the expression of Arg-1. After treatment with LPS and SjCystatin for 24 h, the cells were harvested and cell lysates were subject to Western blot.Mean±SD.n=4.

图9PI3K/AKT 信号通路抑制剂对 SjCystatin诱导M2巨噬细胞极化后Arg-1蛋白水平的影响

2.3PI3K/AKT 信号通路抑制剂对 SjCystatin诱导的M2巨噬细胞中AKT磷酸化水平的变化如前所述，将SjCystatin 及PI3K/AKT 信号通路抑制剂 LY294002同时加入细胞无血清培养基1 h后观察AKT的磷酸化情况。Western blot实验结果显示，经过LY294002干预后，AKT的磷酸化水平与干预前比较差异没有统计学显著性，见图10。

Figure 10.The effect of PI3K/AKT signaling pathway inhibitor on the expression of p-AKT in polarized M2 macrophages induced by SjCystatin.Mean±SD.n=4.

图10PI3K/AKT 信号通路抑制剂对 SjCystatin诱导M2巨噬细胞极化后p-AKT蛋白水平的影响

讨论

巨噬细胞作为一种具有可塑性和多功能性的细胞群体，在不同的生理和疾病状态中可以表现出不同的表型[6]。不同表型各自拥有独特特征和功能，例如M2a和M2c亚型巨噬细胞拥有参与其代谢过程的重要蛋白Arg-1[7]，而M2b亚型巨噬细胞受到LPS刺激后可以表达出高水平的LIGHT蛋白，且能分泌大量的白介素10和少量的白介素12[8]，而其余亚型巨噬细胞则没有这个生物学特点，因此高表达IL-10和低表达IL-12也被认为是广义的 M2b亚群巨噬细胞的表型标志[7，9]。随着对免疫应答和炎症反应研究的深入，研究人员发现了M2亚型巨噬细胞在治疗炎症性疾病和自身免疫性疾病中的独特作用。Cystatin作为寄生虫产生的免疫调节分子，通过诱导M2巨噬细胞分化为M2b亚型巨噬细胞，从而分泌大量的具有抑炎作用的IL-10，在治疗一些炎症性疾病和自身免疫性疾病方面显示了不错的效果[10]。在本实验中，我们发现SjCystatin诱导活化的巨噬细胞使得6 h IL-12/IL-10比值明显减少且能够分泌大量具有抑炎作用的IL-10， 并能高表达M2b亚型巨噬细胞表面标志物LIGHT的mRNA和蛋白水平，提示着SjCystatin诱导活化的巨噬细胞分化为了M2b亚型巨噬细胞。在12 h M2a和M2c亚型巨噬细胞表面标志物Arg-1的mRNA和蛋白水平表达量的降低也侧面证实了SjCystatin诱导活化的巨噬细胞分化为了M2b亚型巨噬细胞，而不是M2a和M2c亚型巨噬细胞。在24 h Arg-1表达量的增多预示着M2a和M2c亚型巨噬细胞的增多，可能的原因是M2b亚型巨噬细胞分泌的大量IL-10刺激了M2a和M2c亚型巨噬细胞数目的增加，既往实验报道可以解释这种现象[2]。

PI3K/AKT 是公认的细胞内经典的重要信号途径，其具有多种细胞调节功能[11-12]。Hofmann[13]等报道PI3K/AKT信号通路的激活与抑炎介质的产生有关，巨噬细胞的极化也依赖于PI3K/AKT信号通路途径[14]。在本实验中，我们观察到活化的巨噬细胞在受到SjCystatin干预后，巨噬细胞内的p-AKT蛋白水平明显增加，说明受到干预的巨噬细胞在极化为M2b亚型巨噬细胞的过程中，伴随有AKT的活化，这证实了SjCystatin可能通过PI3K/AKT信号通路途径诱导了巨噬细胞的分化。在另一组实验中，在加入了PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002后我们可以观察到IL-10含量减少，24 h M2b亚型巨噬细胞表面标志物LIGHT的mRNA和蛋白水平表达量明显下降，巨噬细胞内的p-AKT蛋白水平增加量降低，提示着PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002的加入降低了SjCystatin诱导活化的巨噬细胞极化为M2b亚型巨噬细胞的效率，侧面证实了M2b亚型巨噬细胞的产生依赖于PI3K/AKT信号通路途径。由此可推断，PI3K/Akt信号通路途径在SjCystatin诱导活化的巨噬细胞极化为M2b亚型巨噬细胞过程中起着重要作用。

本实验证实活化的巨噬细胞在体外实验中被SjCystatin诱导分化为M2b亚型巨噬细胞，并且PI3K/AKT信号通路途径在此过程中起着重要作用。本实验研究让我们对寄生虫SjCystatin免疫调节分子与巨噬细胞之间的关系有了更好的理解，也为进一步研究M2b巨噬细胞在免疫调控和炎症调节方面的应用增添了一份参考。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Effects of PI3K/AKT signaling pathway on polarization of M2 macrophages induced by SjCystatin

LIU Ju, YANG Xiao, YUE Yuan, WANG Le-xun, WU Zhong-kai

(DepartmentofCardiacSurgeryII,TheFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:wuzhk@mail.sysu.edu.cn)

[KEY WORDS]Cystatin; M2b macrophages; M2 macrophages; PI3K/AKT signaling pathway

[ABSTRACT]AIM: To investigate the subtype of M2 macrophages induced bySchistosomajaponicumcystatin (SjCystatin) and to determine the mechanism underlying these effects.METHODS: The releases of IL-10 and IL-12, and the expression of macrophage subtype markers LIGHT (M2b) and Arg-1 (M2a+M2c) were assessed by ELISA, RT-qPCR and Western blot. The phosphorylation level of AKT was assessed by Western blot.RESULTS: SjCystatin promoted the continuous increase in IL-10 level at 6 h, 12 h and 24 h, and increased the amount of mRNA and protein expression of LIGHT, but down-regulated the amount of mRNA and protein expression of AKT. The addition of PI3K/AKT inhibitor reduced the release of IL-10 at 12 h and 24 h, reduced the mRNA and protein expression of LIGHT at 24 h, up-regulated the mRNA and protein expression of Arg-1 at 24 h, and decreased the phosphorylation level of AKT.CONCLUSION: SjCystatin promotes the differentiation of M2 macrophage to M2b macrophage subtype, and the PI3K/AKT signaling pathway is involved in this process.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 0971- 07

[收稿日期]2016- 03- 21[修回日期] 2016- 05- 11

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81570039)； 广东省自然科学基金资助项目(No. S2013040012612)

通讯作者△Tel: 020-87755766-8816； E-mail: wuzhk@mail.sysu.edu.cn

[中图分类号]R392.21; R363

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.002