大蒜素对病毒性心肌炎小鼠的治疗作用*

陈小龙，　王立峰，　王　璐，　王正斌

(1南阳医学高等专科学校第一附属医院心血管内科,河南 南阳 473000;2郑州大学第一附属医院心血管内科,河南 郑州 450052)



大蒜素对病毒性心肌炎小鼠的治疗作用*

陈小龙1，王立峰1，王璐1，王正斌2△

(1南阳医学高等专科学校第一附属医院心血管内科,河南 南阳 473000;2郑州大学第一附属医院心血管内科,河南 郑州 450052)

[摘要]目的： 观察大蒜素(garlicin, Gal)注射液对病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)小鼠的作用并探讨其可能的作用机制。方法: 将40只BALB/c健康小鼠随机分为4组：正常组(control组)、VMC模型组以及大蒜素低剂量组(Gal-L组)与高剂量组(Gal-H组)；经相应处理后，HE染色观察心肌组织形态；比色法检测血清中乳酸脱氢酶(LDH)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和肌酸激酶(CK)的水平；Western blot检测心肌组织中Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP与cleaved-caspase-8的蛋白水平。结果: HE染色结果显示大蒜素能减少病毒性心肌炎小鼠心肌组织的坏死与炎性细胞的浸润；与VMC组相比，大蒜素呈浓度依赖性降低血清中LDH、AST和CK的水平，同时，降低心肌组织中Bax、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的蛋白表达水平，升高Bcl-2的蛋白表达水平，而cleaved-caspase-8的蛋白水平不变。结论: 大蒜素能有效改善病毒性心肌炎小鼠的心肌损伤，降低血清中LDH、AST和CK的水平，其可能的作用机制可能与内源性细胞凋亡通路有关。

[关键词]大蒜素； 病毒性心肌炎； 乳酸脱氢酶； 天门冬氨酸氨基转移酶； 肌酸激酶； 内源性细胞凋亡通路

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是一种急性病毒感染引起的急性心肌局限性或弥漫性病变，是儿科常见的心血管疾病之一，部分患者由于经久不愈逐步进展演变为扩张型心肌病和心力衰竭[1-2]。VMC的发病机制尚不明确，多年研究表明可能与病毒的直接损伤、自身免疫机制缺陷、细胞凋亡等有关。因此，对病毒性心肌炎发病机制的研究是目前较热的领域，亟需探索发病机制为寻找有效的防治方法提供依据。

大蒜素(garlicin, Gal)是大蒜的主要有效成分，具有抗菌杀虫能力强，抗菌谱广的特点，此外还具有抗肿瘤、降胆固醇、降血压及预防心血管疾病等作用[3]。有研究表明大蒜素能够有效改变冠心病心绞痛患者心电图S-T段及T波异常改变。此外，在常规治疗上加入大蒜素治疗，能有效改善室上性早搏，推测是通过延长心肌细胞的有效不应期发挥作用[4-5]。蓝景生等[6]对大蒜素注射液治疗急性病毒性心肌炎60例患者的临床疗效进行研究，发现大蒜素注射液治疗的患者在临床症状、心电图异常与心肌酶学指标方面均优于病毒唑注射液的疗效，提示大蒜素具有减少心肌损伤，改善心肌细胞功能的效果，但未对其作用机制进行研究。我们通过建立病毒性心肌炎小鼠模型，观察大蒜素对小鼠心肌组织的作用，并探讨大蒜素对病毒性心肌炎产生作用的初步机制。

材料和方法

1实验动物

4周龄BALB/c健康小鼠，SPF级，雄性，体重16～18 g，购自斯莱克公司。

2药物与试剂

大蒜素注射液购自上海禾丰制药厂； 乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)和肌酸激酶(creatine kinase，CK)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP与cleaved-caspase-8抗体购自Santa Cruz；其它试剂均为国产试剂纯。

3方法

3.1病毒处理嗜心性柯萨奇病毒B3(Coxsackie virus B3，CVB3)Nancy株由河北医科大学病原微生物教研室惠赠，扩增方法参照[7]进行，在HEp-2细胞传代，反复冻融3次，800×g离心20 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱保存备用。测得其半数组织培养感染剂量(TCID50)是10-3/L。

3.2动物模型建立与分组将40只4周龄BALB/c健康小鼠随机分为正常对照组(control组)、VMC模型组以及大蒜素低剂量组(Gal-L组)与高剂量组(Gal-H组)。除control组外，其余组小鼠腹腔注射0.1 mL含100 TCID50 CVB3的病毒悬液；造模24 h后给药，Gal-L组与Gal-H组分别腹腔注射大蒜素20 mg/kg与40 mg/kg，VMC模型组给予等剂量的生理盐水。每日给药 1 次，共7 d。

3.3心肌组织的病理观察给药完成24 h后处死，取小鼠心尖组织，用10%甲醛固定，分别经过梯度乙醇(75%→85%→95%→100%)脱水，用石蜡包埋后切片，苏木素染色5 min，盐酸乙醇分化30 s，伊红复染，再次用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

3.4血清学指标的检测给药完成24 h后，断头取血，离心，分离血清，采用比色法检测血清中LDH、AST和CK的水平。

3.5Western blot检测取各组大鼠心肌组织，提取细胞总蛋白，用紫外分光光度计进行定量，并调整蛋白量。取等量裂解产物，进行SDS-PAGE。电转至硝酸纤维素膜上，加入封闭液，室温封闭3 h，封闭结束后PBST洗膜5 min，加入 I 抗孵育4 ℃过夜，PBST洗膜2次；再加入相对应 II 抗，室温孵育2 h，PBST洗膜2次，将膜放入显色液中显色，凝胶成像系统扫描灰度值进行分析。

4统计学处理

采用SPSS 15.0统计软件进行统计分析，所有实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析，各组均数间的两两比较采用Bonferroni校正的t检验，统计结果以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1各组小鼠心肌组织的病理变化

如图1所示，control组大鼠心肌组织排列整齐，无炎性细胞浸润；VMC组大鼠心肌组织广泛坏死，出现空泡，广泛炎性细胞浸润，部分心肌细胞萎缩；Gal-L组大鼠心肌组织部分坏死，崩解，细胞排列紊乱，有炎性细胞浸润；Gal-H组大鼠心肌组织部分坏死，血管周围少部分有炎性细胞浸润。

Figure 1.HE staining of the myocardium with different treatments (×400).

图1各组大鼠心肌组织HE染色

2血清学指标的变化

与control组相比，VMC组中LDH、AST和CK的水平显著升高(P<0.05)；与VMC组相比，Gal-L组与Gal-H组LDH、AST和CK的水平明显降低(P<0.05)，其中Gal-H组的下降幅度更大，见图2。

Figure 2.The levels of LDH, AST and CK in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsVMC.

图2各组大鼠血清中LDH、AST和CK的水平

3心肌组织中Bcl-2和Bax的蛋白表达水平

Western blot检测结果显示，与control组相比，VMC组的Bax蛋白表达显著上升(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表达显著降低(P<0.05)；与VMC组相比，Gal-L组与Gal-H组的Bax蛋白表达明显下降(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表达明显上升(P<0.05)，而Gal-H组的变化幅度最大。Bax/Bcl-2的比值在给予大蒜素处理后显著低于VMC组(P<0.05),见图3。

Figure 3.The protein expression of Bcl-2 and Bax. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsVMC.

图3Bcl-2和Bax蛋白表达水平的变化

4心肌组织中cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP与cleaved-caspase-8蛋白水平的变化

如图4所示，与control组相比，VMC组的cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的蛋白表达显著上升(P<0.05)，cleaved-caspase-8的蛋白表达无变化；与VMC组相比，Gal-L组与Gal-H组的cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的蛋白水平明显下降(P<0.05)，其中Gal-H组的下降幅度最大，cleaved-caspase-8的蛋白表达无变化。

讨论

细胞凋亡是细胞衰老死亡形式之一，在许多组织的生理病理过程中均会发生，通常与疾病的产生有关。近年来，有许多报道指出心脏疾病中存在心肌细胞凋亡，心肌细胞凋亡的异常在病毒性心肌炎的发病中起重要作用[8]。国内有学者研究发现细胞膜上的表面分子caveolin-3可能通过调节TGF-β1蛋白的活性，进而影响其下游蛋白Smad3的表达，从而在病毒性心肌炎的发病中起作用[9]。张松等[8]研究发现细胞可能通过穿孔素与颗粒酶作用从而启动细胞凋亡；此外还可能通过激活的T淋巴细胞经由Fas/FasL与靶细胞结合，从而向细胞内传导死亡信号，使细胞发生凋亡[10]。本实验结果显示，给予大蒜素处理后，病毒性心肌炎小鼠心肌组织的炎性细胞浸润较少，细胞坏死、破裂减少，且作为病毒性心肌炎诊断重要标志的心肌酶(LDH、AST、CK)有明显下降。在临床早期，由于心电图诊断缺乏特异性，临床上一般采用心肌酶水平的检测来间接衡量心肌细胞的损害程度。

Figure 4.The protein expression of cleaved-caspase-9, cleaved-caspase-3, cleaved-PARP and cleaved-caspase-8. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsVMC.

图4Cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP与cleaved-caspase-8蛋白水平的变化

抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax作为细胞内源性凋亡通路的重要调节因子，二者的蛋白表达比例对线粒体的完整性具有非常重要的作用。当Bcl-2蛋白表达下降而Bax蛋白表达上升，会促使线粒体中的凋亡因子释放至细胞质基质中，激活caspase-9，已激活的caspase-9进一步激活其下游因子caspase-3，随后caspase-3的切割底物PARP被切割激活后形成DNA碎片，称为内源性线粒体凋亡途径[11]。本实验研究结果显示，给予大蒜素处理后，Bcl-2蛋白表达增加而Bax蛋白表达降低，提示大蒜素可能具有抑制心肌细胞凋亡的作用。另外与VMC组相比，经大蒜素处理后，心肌组织中cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的蛋白表达增加，而cleaved-caspase-8蛋白表达不变，提示大蒜素是通过内源性细胞凋亡途径(线粒体依赖途径)发生作用，而不是非线粒体依赖途径发生作用。

综上所述，大蒜素可能具有抑制病毒性心肌炎心肌细胞凋亡的作用，其可能通过抑制内源性细胞凋亡通路来抑制细胞凋亡。

[参考文献]

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[6]蓝景生，潘兴寿，黄照河，等. 大蒜素治疗急性病毒性心肌炎的临床研究[J]. 中医药临床杂志，2006, 18(4):382-384.

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[8]张松，葛均波，饶邦复.病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡及心肌病变的电子显微镜观察[J]. 医学研究杂志, 2007, 36(1):53-55.

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[11]Savitskaya MA, Onishchenko GE. Mechanisms of apoptosis[J]. Biochem (Mosc), 2015, 80(11):1393-1417.

(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Effect of garlicin on viral myocarditis in mice

CHEN Xiao-long1, WANG Li-feng1, WANG Lu1, WANG Zheng-bin2

(1DepartmentofCardiology,FirstAffiliatedHospitalofNanyangMedicalCollege,Nanyang473000,China;2DepartmentofCardiology,FirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China.E-mail:wangxqmed@126.com)

[KEY WORDS]Garlicin; Viral myocarditis; Lactate dehydrogenase; Aspartate aminotransferase; Creatine kinase; Intrinsic apoptosis pathway

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of garlicin on mouse viral myocarditis and to explore the possible mechanisms. METHODS: Forty BALB/c mice were randomly divided into 4 groups: control group, viral myocarditis group, low-dose garlicin group and high-dose garlicin group. The morphological changes of the myocardium were observed with HE staining. The levels of lactate dehydrogenase (LDH), aspartate aminotransferase (AST) and creatine kinase (CK) were measured by colorimetric method. The protein levels of Bcl-2, Bax, cleaved-caspase-9, cleaved-caspase-3, cleaved-PARP and cleaved-caspase-8 in the myocardial tissues were determined by Western blot. RESULTS: The morphological observation with HE staining showed that garlicin inhibited the necrosis of the myocardium and infiltration of inflammatory cells. Compared with viral myocarditis group, garlicin dose-dependently decreased the levels of LDL, AST and CK. Moreover, garlicin treatment decreased the protein levels of Bax, cleaved-caspase-9, cleaved-caspase-3 and cleaved-PARP, accompanied with an increase in Bcl-2 expression. However, garlicin had no effect on the protein level of cleaved-caspase-8. CONCLUSION: Garlicin effectively attenuates the myocardial damage in mice with viral myocarditis through inhibition of intrinsic apoptosis pathway.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 1027- 04

[收稿日期]2015- 12- 07[修回日期] 2016- 02- 25

*[基金项目]河南省教育厅基础研究项目课题(No. 142300410063)

通讯作者△Tel： 0371-67966261； E-mail: wangxqmed@126.com

[中图分类号]R542.2+1； R363.2

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.011