褐藻素对HSC-T6细胞生长和凋亡的影响*

戴启心，　宋　伟，　张润锦，　王　恺，　邹书兵

(南昌大学第二附属医院肝胆外科，南昌 330006)



褐藻素对HSC-T6细胞生长和凋亡的影响*

戴启心，宋伟，张润锦，王恺△，邹书兵△

(南昌大学第二附属医院肝胆外科，南昌 330006)

[摘要]目的： 探讨褐藻素对HSC-T6细胞生长和凋亡的影响。方法: 将HSC-T6细胞分为空白对照组、阴性对照组及药物组，用不同浓度的褐藻素培养HSC-T6细胞。采用CCK-8检测在24 h、48 h和72 h褐藻素对HSC-T6细胞活力变化的影响，流式细胞术检测细胞周期和凋亡，Western blot法分别检测Bcl-2和Bax的蛋白表达。结果: 与空白对照组相比，CCK-8检测的结果表明，褐藻素在一定浓度范围内(15～75 μmol/L)内能显著抑制HSC-T6细胞的活力(P<0.01)，呈剂量和时间依赖性。流式细胞术结果显示，24 h后高浓度(60 μmol/L)组对HSC-T6细胞周期影响的效果显著(P<0.01)，G1期比例显著下降(P<0.01)，G2期和S期的比例显著升高(P<0.01)，48 h后低浓度(15 μmol/L)和中浓度(30 μmol/L)组对HSC-T6细胞周期的阻滞作用增强，呈剂量依赖性(P<0.05)；低、中、高浓度组早期凋亡率和总凋亡率都显著升高，呈剂量依赖性(P<0.05)。蛋白印迹法实验结果表明，低、中、高浓度组Bax的蛋白表达显著上调，中、高浓度组Bcl-2的蛋白表达显著下调(P<0.05)。结论: 褐藻素可以通过使细胞周期阻滞于S期和G2期而抑制HSC-T6细胞生长；同时能通过下调Bcl-2和上调Bax的表达而诱导HSC-T6细胞凋亡。

[关键词]褐藻素； HSC-T6细胞； 细胞活力； 细胞周期； 细胞凋亡； Bcl-2； Bax

肝纤维化常继发于肝脏慢性炎症性损伤，而在慢性炎症阶段，肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)持续激活后分泌大量细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，以至于其合成与分解代谢失衡而过度沉积于肝脏，是肝纤维化发展中的关键因素[1]。因此，抑制肝星状细胞的活化与增殖是治疗肝纤维化的重要策略[2]。HSC-T6细胞是雄性SD大鼠肝脏分离培养后，具有活化HSC的表型，有快速增殖及稳定传代的能力，常被用作于肝纤维化研究的对象[3]。而褐藻素(fucoxanthin,Fu)是可食用藻类中提取出的一种天然类胡萝卜素，具有抗炎反应及促进多种肿瘤细胞凋亡等作用[4]，本研究采用HSC-T6细胞系，研究褐藻素对HSC-T6细胞的生长和凋亡的影响，并探讨其抗纤维化的作用机制。

材料和方法

1材料

大鼠肝星状细胞系HSC-T6购自湘雅细胞库；褐藻素购自Sigma；胎牛血清购自Biological Industries；RPMI-1640培养基和胰蛋白酶(不含EDTA)购自Solarbio；CCK-8试剂盒、胰蛋白酶(含EDTA)和HRP标记山羊抗兔IgG购自北京全式金生物科技有限公司；无水乙醇购自西陇化工股份有限公司；细胞周期检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；细胞凋亡检测试剂盒购自BD；Bcl-2和Bax兔抗鼠多克隆抗体购自Proteintech。

2方法

2.1褐藻素存储液的配制褐藻素粉末按15 mmol/L溶解于无水乙醇中，-20 ℃避光保存。使用时用RPMI-1640培养基稀释至所需浓度。

2.2HSC-T6培养与分组HSC-T6复苏后置于含10%胎牛血清及双抗(1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素)的RPMI-1640培养基中，37 ℃、饱和空气湿度和5%CO2的孵育箱内培养。细胞呈贴壁生长，取对数生长期的细胞进行实验，设置空白对照组，阴性对照组，不同浓度(15、30、45、60和75 μmol/L)药物组。

2.3CCK-8法检测HSC-T6细胞的活力 收集对数期HSC-T6细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 μL细胞悬液，铺板细胞密度为每孔1×104浓度接种于96孔板。隔夜细胞贴壁，按实验分组加入不同浓度褐藻素处理24 h、48 h和72 h后，每孔加入10 μL的CCK-8试剂，在孵育箱中继续染色2 h后在酶标仪上测定波长450 nm处各孔吸光度(A)值。每组5复孔，计算各组的平均值。

2.4流式细胞术检测细胞周期收集对数期HSC-T6细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入2 mL细胞悬液，铺板细胞密度为每孔8×105浓度接种于6孔板中。隔夜细胞贴壁，按实验分组加入不同浓度褐藻素处理24 h后，用胰酶(不含EDTA)消化并收集细胞，用PBS洗涤1次。于70%乙醇中4 ℃固定2 h后，1 200 r/min离心5 min，弃去乙醇，并用PBS洗涤2次。用RNA酶100 μL混匀，37 ℃水浴30 min，后加入碘化丙啶 (propidium iodide，PI) 400 μL染色悬浮细胞，在避光、4 ℃孵育30 min，在流式细胞仪检测细胞周期的变化。

2.5流式细胞术检测细胞凋亡率收集对数期HSC-T6细胞，每孔加入2 mL细胞悬液，以每孔8×105接种于6孔板中。设定不同实验组，隔夜细胞贴壁，按实验分组加入不同浓度褐藻素处理24 h后，用胰酶(不含EDTA)消化并收集细胞，用PBS洗涤2次，100 μL 1×binding buffer重悬细胞后，分别加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI并使其混匀，室温、避光的条件下孵育15 min，再加入400 μL 1×binding buffer后于流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2.6Western blot法检测褐藻素对HSC-T6细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响采用蛋白抽取液分别提取空白对照组和药物组细胞的总蛋白，全自动生化分析仪(Beckman)测定蛋白浓度。取30 μg细胞总蛋白经5×上样缓冲液和30 g/L SDS配平蛋白至同体积后进行100 g/L SDS-PAGE,转移至PVDF膜上。以50 g/L脱脂奶粉常温封闭150 min，分别用兔抗鼠Bcl-2多克隆抗体、兔抗鼠Bax多克隆抗体和兔抗鼠GAPDH单克隆抗体孵育过夜。洗涤后分别加入HRP-标记山羊抗兔II抗，加入底物化学发光试剂后X线片曝光，曝光显影的目的条带用软件进行半定量分析，以内参照为参考标准计算出目的条带标准化后的相对值，以此判断蛋白相对表达量。

3统计学处理

应用SPSS 13.0进行统计分析，数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1褐藻素对HSC-T6细胞活力的影响

与对照组比较，随着褐藻素浓度的增加及时间的延长，各浓度药物组HSC-T6细胞的活力明显受抑制，且不同褐藻素浓度均以72 h抑制HSC-T6细胞活力的作用最为明显，这表明褐藻素呈现明显时间和剂量依赖性地抑制HSC-T6细胞的活力，差异有统计学显著性。各时段空白对照组与阴性对照组比较，差异均无明显统计学显著性，表明药物组中最大剂量的乙醇(0.5%乙醇)对HSC-T6细胞活力无影响，见表1。

表1各组培养24 h、48 h、72 h时T6细胞的增殖情况

Table 1.Comparison of HSC-T6 cell proliferation among different groups at 24 h, 48 h and 72 h by CCK-8 assay (Avalue. Mean±SD.n=3)

**P<0.01vsblank control;#P<0.05,##P<0.01vsFu 15 μmol/L;＊P<0.05,＊＊P<0.01vsFu 30 μmol/L;&&P<0.01vsFu 45 μmol/L;△P<0.05,△△P<0.01vsFu 60 μmol/L.

2褐藻素对HSC-T6细胞周期的影响

流式细胞术结果显示，各药物组处理24 h后，与对照组相比，15 μmol/L和30 μmol/L药物组变化趋势不明显，差异无统计学显著性，而60 μmol/L药物组G0/G1期细胞比例明显下降(P<0.01)，S期和G2/M期细胞比例明显上升(P<0.01)；15 μmol/L组和30 μmol/L组作用48 h后，与对照组相比，G0/G1期细胞比例明显下降(P<0.05)，S期和G2/M期细胞比例明显上升(P<0.05)，且阻滞作用随药物浓度的增加而增强, 见图1、表2、表3。

Figure 1.The representative images of the cell cycle of HSC-T6 cells treated with different concentrations of fucoxanthin for 24 h or 48 h. See Table 2 and Table 3 for the quantitative analysis.

图1褐藻素作用24 h和48 h各组细胞的周期分布

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsFu 15 μmol/L;＊＊P<0.01vsFu 30 μmol/L.

*P<0.05，**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsFu 15 μmol/L.

3褐藻素对HSC-T6细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，各药物组处理24 h后，其早期凋亡率和总凋亡率均显著升高(P<0.05)，凋亡率随药物浓度的增加而升高，见图2。

Figure 2.The effects of fucoxanthin at different concentrations on the apoptosis of HSC-T6 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

图2流式细胞术细胞检测各组细胞凋亡的变化

4褐藻素对HSC-T6细胞Bcl-2和Bax表达水平的影响

Western blot结果显示，在各组细胞处理24 h后，随着药物浓度的增加，与对照组相比，Bax的表达明显升高，同时，中浓度和高浓度的Bcl-2的表达也明显降低，差异有统计学显著性(P<0.05)，而低浓度组的Bcl-2的表达无明显变化，见图3。

Figure 3.The effects of fucoxanthin at different concentrations on the protein expression of Bax and Bcl-2 in the HSC-T6 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

图3褐藻素对HSC-T6细胞Bax和Bcl-2表达的影响

讨论

随着对肝纤维化发生机制的不断了解，研究者发现各种原因导致的肝细胞损伤会激活静息状态下的肝星状细胞转化为肌纤维母细胞，再通过不断地自分泌和旁分泌作用，激活更多的肝星状细胞，使细胞外基质合成增加以至在肝内过度沉积是肝纤维化的中心环节[5]。所以，对肝纤维化的早期诊断、早期治疗不仅可以逆转肝纤维化，甚至能有效防止肝硬化的发生。

目前，已有大量实验证实从藻类植物中提取的化合物具有一定的护肝作用，但均尚未明确是何种化合物[6-7]。而本实验中所运用的褐藻素亦称岩藻黄质、岩藻黄素，属于海产类胡萝卜素，能从一些藻类植物(如裙带菜、海带、马尾藻等)中提取[8]。虽然褐藻素具有抗炎、抗氧化及抗肿瘤等多种生物学效应，但是，褐藻素的抗纤维化作用尚无明确的研究探讨。

本实验就是将褐藻素作用于雌性SD大鼠活化的肝星状细胞即HSC-T6细胞，通过CCK-8实验结果表明，与空白对照组相比，在一定范围内(15 ～75 μmol/L)，各药物浓度组均存在显著性差异，随着褐藻素药物浓度的增加，HSC-T6细胞活力明显受到抑制，呈现时间和剂量依赖性，而阴性对照组(乙醇)对细胞活力的影响与空白对照组比较差异无统计学显著性，提示褐藻素对HSC-T6细胞的生长具有抑制作用，并与乙醇的作用无关。流式细胞术检测细胞周期结果表明，与空白对照组相比，低浓度(15 μmol/L)和中浓度(30 μmol/L)组周期变化均不明显，而高浓度(60 μmol/L)组与前3组比较，G0/G1期细胞比例明显减少，S期和G2/M期细胞比例明显增高，提示高浓度褐藻素作用HSC-T6细胞周期阻滞于S期和G2/M期。对于低浓度和中浓度细胞周期变化不明显，考虑可能因作用时间短且药物浓度较低，致使药效作用未能完全发挥所致，所以补充低浓度组和中浓度组作用48 h后，与空白对照组相比，G0/G1期细胞比例明显减少，S期和G2/M期细胞比例明显增高，说明随着作用时间的延长，褐藻素对HSC-T6细胞周期阻滞作用随药物浓度的增加而增强。初步验证褐藻素可能通过调控细胞周期而抑制HSC-T6细胞的增殖。

Bcl-2蛋白家族是凋亡调节中的主要家族之一，其中有20多种参与调控抑制凋亡和促进凋亡的成员，其中抑制凋亡的主要包括Bcl-2、Bcl-w和Boo等，促进凋亡的主要包括Bax、Bok和Bad等[9-10]。而本实验流式细胞术检测细胞凋亡结果表明，各药物浓度组早期凋亡和总凋亡细胞均较对照组有明显升高，并对药物浓度呈剂量依赖性，提示褐藻素诱导T6细胞凋亡。同时下调Bcl-2蛋白的表达及上调Bax蛋白的表达，因此可初步推测褐藻素通过下调Bcl-2表达及上调Bax表达来诱导T6细胞的凋亡。这与Liu等[11]联合褐藻素和顺铂增强抗肿瘤作用的研究中，增加Bax/Bcl-2的比例来验证其联合作用促进肿瘤细胞凋亡，以及侯莉莉等[12]研究褐藻素促进MCF-7细胞凋亡时，下调Bcl-2蛋白的表达和上调Bax蛋白的表达结果均相类似。

综上所述，褐藻素通过作用于HSC-T6细胞周期，使其阻滞于S期和G2期，从而抑制HSC-T6细胞的生长；可能通过下调Bcl-2蛋白的表达同时上调Bax蛋白的表达诱导HSC-T6细胞的凋亡。提示褐藻素具有一定的抗肝纤维化作用，为进一步探讨褐藻素抗肝纤维化作用的机制奠定了一定的分子基础。

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[12]侯莉莉，许秋菊，胡国强，等. 褐藻素通过内质网途径诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的实验研究[J]. 中国药学杂志, 2014, 49(2):117-120.

(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Effect of fucoxanthin on growth and apoptosis of HSC-T6 cells

DAI Qi-xin, SONG Wei, ZHANG Run-jin, WANG Kai, ZOU Shu-bing

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail：neswk@163.com;zousb999@163.com)

[KEY WORDS]Fucoxanthin; HSC-T6 cells; Cell viability; Cell cycle; Apoptosis; Bcl-2; Bax

[ABSTRACT]AIM: To explore the effect of fucoxanthin (Fu) on the growth and apoptosis of HSC-T6 cells. METHODS: HSC-T6 cells were divided into blank control group, negative control group and drug groups (treated with different concentrations of Fu). The cell viability was detected by CCK-8 assay at 24 h, 48 h and 72 h after Fu treatment. The cell cycle distribution and apoptotic rate were analyzed by flow cytometry. The protein expression of Bcl-2 and Bax were detected by Western blot. RESULTS: Compared with blank control group, the viability of HSC-T6 cells was inhibited by Fu at concentrations of 15～75 μmol/L in a dose- and time-dependent manner (P<0.01). The cell ratio of G1phase was significantly decreased (P<0.01) and the cell ratio of S phase and G2phase was significantly increased (P<0.01) in 60 μmol/L Fu group after 24 h. The cell ratio of G1phase was significantly decreased (P<0.05) and the cell ratio of S phase and G2phase was significantly increased (P<0.05) in 15 μmol/L and 30 μmol/L Fu groups in a dose-dependent manner after 48 h. The early cell apoptotic rates and total cell apoptotic rates were significantly increased in the Fu treatment groups in a dose-dependent manner (P<0.05). The protein expression of Bax was significantly increased in the Fu treatment groups and the protein expression of Bcl-2 was significantly decreased in 30 μmol/L and 60 μmol/L Fu groups (P<0.05).CONCLUSION: Fu inhibits the growth of HSC-T6 cells possiblely via arresting the cell cycle at S phase and G2phase. The apoptosis of HSC-T6 cells induced by Fu might be via down-regulating the protein expression of Bcl-2 and up-regulating the protein expression of Bax.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 1132- 06

[收稿日期]2015- 11- 23[修回日期] 2016- 03- 22

*[基金项目]江西省自然科学基金资助项目(No.20142BAB205045)

通讯作者△Tel: 0791-6259631; E-mail： neswk@163.com; zousb999@163.com

[中图分类号]R391.11

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.029