反向间接血凝试验（RIHA）在动物疾病诊断中的应用进展

庄金秋，梅建国，王　艳，谢金文，莫　玲，沈志强（. 山东省滨州市畜牧兽医研究院，山东滨州　256600；2. 滨州市贝尔凯瑞生物技术有限公司，山东滨州　256600）



反向间接血凝试验（RIHA）在动物疾病诊断中的应用进展

庄金秋1，2，梅建国1，2，王艳1，谢金文1，莫玲1，沈志强1
（1. 山东省滨州市畜牧兽医研究院，山东滨州256600；2. 滨州市贝尔凯瑞生物技术有限公司，山东滨州256600）

摘要：反向间接血凝试验（RIHA）是一种简单实用的实验室检测技术，已广泛应用于人类及动物疾病的田间及临床检测。本文概述了RIHA在动物病毒病、细菌病和寄生虫病诊断方面的应用进展，以期为兽医临床科技工作者更好地应用该法诊断疾病提供参考。

关键词：反向间接血凝试验；诊断；应用

反 向 间 接 血 凝 试 验（reverse indirect hemagglutination test，RIHA）是以红细胞为载体的间接凝集试验，即用已知的抗体致敏红细胞，然后与样品在适宜的条件下反应。如果样品中含有目的抗原，则抗原和抗体会发生特异性结合，红细胞随反应的发生出现肉眼可见的凝集现象。RIHA是一种简单、实用的实验室检测技术，其显著特点是操作简便、快速，结果准确，无需特殊仪器和试剂，现场适应性高，已广泛应用于人类及动物疾病的田间及临床检测。本文综述了RIHA在动物疾病诊断中的应用进展，以期为兽医临床中致力于疾病诊断的科研工作者提供参考。

1　动物病毒病

1.1猪病

RIHA是我国鉴定口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，FMDV）的行业标准，该方法能够快速对FMDV进行初步鉴定。用A、O、C型口蹄疫的豚鼠高免血清致敏猪水疱病病毒（swine vesicular disease virus，SVDV）高免血清抗体球蛋白，用1%戊二醛、甲醛固定的绵羊红细胞制备的抗体红细胞，与不同稀释度的待检抗原进行RIHA试验，可在2～7 h内快速区别诊断猪水疱病和口蹄疫。何永强等［1］通过单克隆抗体斑点酶联免疫吸附试验（McAb Dot-ELISA）和RIHA分别对猪FMDV和SVDV检测比较。结果表明，McAb Dot-ELISA特异性强，快速简便，比RIHA更为敏感、稳定和直观。RIHA虽然灵敏度较高，但个别被检抗原可能在低稀释度孔内出现非特异性凝集。用猪瘟病毒（Clssical swine fever virus，CSFV）免疫血清提取IgG并且纯化后，致敏绵羊红细胞，建立RIHA方法，可用于检测脾脏、淋巴结、扁桃体等病原较集中存在的组织中的CSFV抗原。不足之处在于处理组织病料的方法有差异，所以易对组织中的血细胞造成干扰，从而出现非特异性凝集，导致难以判定结果。吴平等通过单抗致敏的绵羊红细胞建立的RIHA试验来检测猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV），结果与血清中和试验（SN）的符合率为94.4%，并认为RIHA可作为一种PRV的常规诊断技术。应用猪轮状病毒（Rotavirus，RV）IgG，致敏经双醛一次固定的绵羊红细胞，可直接检查样品中的RV。何孔旺等认为RIHA试验能在1.5～2 h内直接从粪便样品中检测出RV抗原。应用RIHA试验检侧日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV），对感染鼠的脑检测敏感性可达1：1 000以上，具有较高的特异性和检出率，可在3 h内得到结果。黄志鑫等采集大约、长白、杜洛克和汉普夏等品种的猪血清样品87份，应用RIHA试验检测猪源乙型肝炎病毒抗原（HBsAg），结果检出阳性3份，阳性率为3.4%，具有较好的特异性和敏感性。

1.2羊病

国内外已有研究人员成功建立了检测山羊痘病毒（Coatpoxvirus，GPV）的RIHA方法，其不仅可以检测组织病料中的GPV，而且还可以检测感染细胞培养物中的GPV。用致敏的绵羊红细胞可以诊断山羊痘，其中绵羊红细胞的致敏方法有多种。Rao等［2］应用戊二醛或丹宁酸进行绵羊红细胞致敏试验，结果在绵羊痘的诊断中取得较好的效果。王开功等［3］、陈伯祥等［4］以兔抗山羊痘病毒IgG致敏绵羊红细胞来检测GPV抗原，并在贵州省疫区进行了现场山羊痘待检抗原检测，结果显示RIHA方法较琼脂扩散试验（AGP）更敏感，表明其建立的方法可用于山羊痘的诊断和流行病学检测，是一种灵敏、操作简单、快速的检测方法。陈燕军用RIHA试验对羊传染性脓疱病毒（Contagious ecthyma virus，CEV）进行了研究，证实了该方法的可行性和特异性。

1.3兔病

孙智锋等将抗兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）的 AA8-1和CG4-1两株单抗分别致敏双醛化人红细胞，混合后建立了单抗反向间接血凝（McAb-RIHA）方法。其敏感性较常规血凝试验（HA）高256倍，最小检出量为0.214 ng/mL。此法在感染兔的心、肝、脾、肺、骨髓、血液等组织中的RHDV检出率均为100%；在脊髓、淋巴结、肌肉等组织中的检出率分别为62.5%、58.3%和37.5%。HA的检出率除在肝中为100%外，其余均低于McAb-RIHA。该方法不能检出脊髓、淋巴结和肌肉样品中的病毒抗原。

1.4禽病

赵新柳应用RIHA检测鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）。结果表明：用纯度过高的抗原制备的高免血清致敏红细胞后，检测IBV的敏感度反而下降；而用聚乙二醇（PEG）将病料浓缩后，IBV检出率明显提高。毕玉霞［5］认为RIHA可用于检测IBV抗原，但可靠性不及SN。樊晓京等［6］应用反向间接血凝抑制试验（RPHI）检测鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease，IBD）血清抗体，得到了满意的效果。用RPHI和AGP两种方法同时测定67份鸡血清样品，其中用AGP检出22份阳性，检出率为32.8%；用RPHI检出62份阳性，检出率为92.5%。在用AGP检出的22份阳性血清中，用RPHI亦均检测为阳性；而AGP检测阴性的45份血清中，用RPHI却检出40份阳性。因此RPHI的检出率比AGP高约60%。Deng等的研究报道证实，用RIHA法检测鸭瘟病毒（Duck Plague Virus），3 h后可判读结果。该方法操作简便，不需昂贵的设备试剂，致敏细胞可长期保存，只是敏感性较低，不适合少量DPV检测。对于DPV的定性检测来说，当感染病鸭大量排毒而使送检组织中存在大量病毒时，RIHA方法足够敏感，具有实用价值。徐为燕等应用RIHA检测鹅胚尿囊液中的鹅细小病毒（Goose parvovirus，GPV），郭玉璞等对此法做了进一步完善。孙怀昌等将用纯抗病毒单抗IgG致敏鹅或绵羊红细胞建立了RIHA试验，并对提纯抗GPV抗原进行了检测，结果显示最低检出浓度分别为34 ng/mL和26 ng/mL；在试验感染鹅胚尿囊液、发病雏鹅组织及粪便中的检出率分别为100%（10/10）、81%（27/33）和91%（21/23）。结果还显示，该方法可对番鸭细小病毒（MDPV）、鸡新城疫病毒（NDV）、猪细小病毒（PPV）及犬细小病毒（CPV）进行鉴别诊断。该方法相对简单，适用于大批量检测GPV感染样品。

1.5犬病

丁壮等应用RIHA检测犬血清，发现乙肝表面抗原（HBsAg）阳性率为14.67%（11/75），再用酶联免疫吸附试验（ELISA）复检，结果两者的阳性符合率高达92%，阴性符合率为100%。该研究对2 431份军犬血清进行了流行病学调查，发现RIHA和ELISA的HBsAg阳性符合率为89.2%，阳性率为6.64%（157/2431）。

2　动物细菌病

2.1鼠疫

鼠疫（Pestis）是啮齿动物和蚤把鼠疫杆菌（Yersinia pestis）传给人和动物的一种特殊的人兽共患病。王祖郧等［7］对比鼠疫RIHA与鼠疫细菌培养两种方法的检菌结果，发现动物和人被鼠疫杆菌感染后，鼠疫RIHA的阳性率（100%）明显高于细菌培养（87%）；对腐败材料中鼠疫菌的检测，RIHA诊断效果明显优越于细菌培养，其在细菌培养阴性的情况下，仍能检出鼠疫杆菌抗原。RIHA在鼠疫诊断中，具有敏感、简便和快速的特点，有助于及时确定疫源的存在和对疫情的判定，在实际工作中便于应用和推广，有望成为鼠疫实验室诊断标准之一。李存香等［8］同时用胶体金免疫层析法（GICA）、RIHA和细菌分离培养法平行检测6株疑似鼠疫样本，结果均为阳性。RIHA检测只能做追溯诊断或提供间接诊断依据。它可检查活菌、死菌，以及腐败材料中的细菌，甚至在腐败1年后的材料中仍可获得阳性结果，对判定鼠疫流行和追溯疫源有一定意义。用该方法判定结果最短需2 h，还需要有一定的技术要求，否则容易出现非特异性凝集。

2.2细菌毒素

RIHA法能够检测出样品中微量的金黄色葡萄球菌肠毒素，而不需要浓缩样品浸液。该技术是先将金黄色葡萄球菌各型肠毒素抗血清通过化学试剂吸附或偶联于绵羊、鸡和人的红血球表面，然后再加入被检的含有相应肠毒素的标本，出现血细胞凝集即为阳性。该试验简便、快速，检出灵敏度高，可达1 ng/mL，只需1～3 h即可判定结果。杨连华等［9］应用RIHA技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）的检测限为10.4 ng/mL，金黄色葡萄球菌肠毒素C（SEC）的检测限为12.0 ng/mL。但该方法所用致敏红细胞抗原或抗体的纯度要高，且在检测中的人为干扰因素较多，因此只能作为一种初步的定性检测方法。袁万哲等［10］利用黏附素单因子血清IgG致敏绵羊红细胞，建立了定量产肠毒素性大肠杆菌黏附素抗原的RIHA试验。经交叉试验、抑制试验和敏感性试验，证实该试验具有很高的特异性和敏感性，可用于生物制品中黏附素含量的定量。

王开功等［11］采用兔抗魏氏梭菌α-毒素IgG致敏马红细胞，建立了RIHA试验。该诊断试剂与魏氏梭菌标准株的培养上清液发生特异的凝集反应，在PBS缓冲液中不自凝，与其他致病菌培养上清无交叉反应。对现场分离样品的检测结果表明，该方法与其生化试验结果的符合率为97.2%，可用于魏氏梭菌病的快速临床诊断。马鹤松等为快速特异诊断水貂肉毒梭菌中毒，进行了水貂实验性肉毒中毒的RIHA诊断试验。RIHA是较理想的诊断水貂C型肉毒中毒的手段，具有快速、灵敏、特异的优点，不仅可在致死貂尸体上取料确诊，还可将有临床症状表现的未致死病貂处死后取料诊断。郑庆端等应用RIHA试验，对人工感染猪丹毒发病猪进行检测，获得较好的结果。其中，耳血的检出率为85.7 %，发病死亡猪脾脏的检查出率为100%。

3　动物寄生虫病

3.1弓形虫病

使用弓形虫虫体抗原或者排泄分泌抗原作为诊断抗原检测血清抗体时，由于抗原的复杂性和非特异性，检测结果往往出现假阳性。为了避免这一现象出现，研究者通过制备弓形虫特异性单克隆抗体作为检测抗体，建立了检测血液中循环抗原（CAg）的McAb-RIHA试验。同时，对于有免疫缺陷的弓形虫感染者来说，循环抗原检测是唯一有效的血清学检测手段。郭志刚等利用单克隆抗体建立了McAb-RIHA试验，它检测出弓形虫速殖子可溶性抗原的最低含量为5 μg/mL，也可检测到弓形虫QHO株速殖子感染绵羊和家兔2～6 d后血清中的CAg。杜重波等研制的抗弓形虫McAb-RIHA诊断试剂，可检测血清弓形虫CAg，具有诊断弓形虫急性或活动性感染的价值，可用于弓形虫病的早期诊断、流产病因学调查和流行病学调查。巩薇等［12］认为现有的RIHA诊断试剂盒主要用于大家畜的诊断，对小鼠的效果不太好，因此在今后对啮齿类实验动物的弓形虫检测时应考虑到这一问题。

3.2旋毛虫病

黄美芳等报道应用McAb-RIHA检测猪旋毛虫病的CAg取得了成功。试测的17例旋毛虫病人中，9例为阳性，应用McAb-RIHA检测CAg与病原学检查的符合率为52.9%。

3.3血吸虫病

李剑瑛等［13］采用McAb-RIHA双盲法测定正常人与各种类型血吸虫病人血清，同时进行交叉反应与重复性试验。结果显示：用McAb-RIHA检测正常人血清的假阳性率为2.17%；对急性、慢性及晚期血吸虫病人检测的阳性率分别为99.39%、84.00%、28.57%，与粪检阳性病人的阳性符合率为84.00%。急性血吸虫病人体内循环抗原含量高于慢性血吸虫病人及晚期血吸虫病人，反应滴度的平均几何数均为慢性血吸虫病人的13.3倍、晚期血吸虫病人的36.4倍；而不同感染度的慢性血吸虫病人体内循环抗原的滴度与其粪中的虫卵数量无明显关系。这证明McAb-RIHA检测日本血吸虫循环抗原有较好的敏感性和特异性。

3.4伊氏锥虫病

叶万祥等在建立的检侧伊氏锥虫CAg的McAb-RIHA基础上，又建立了检侧伊氏锥虫抗体的单克隆抗体-反向间接血凝抑制试脸（McAb-RIHI）。用该法检查实验感染家兔的系列血清和疫区水牛血清，并与目前常规使用的间接血凝（IHA）比较，结果较满意。

3.5猪囊尾蚴病

李莹等［14］应用RIHA试验检测猪囊尾蚴循环抗原，探讨检出量与虫体密度及发育程度关系，为猪囊尾蚴病的诊断研究提供依据。张达琳等［15］用铬离子-单克隆抗体（Cr+++-McAb）鞣酸法致敏绵羊红细胞做RIHA试验，检测囊虫病患者血清中的CAg。该试验敏感性较好，可能是由于Cr+++和鞣酸的作用，使McAb更易吸附在血球上，使得该方法简便易行，快速稳定，在囊虫病的诊断和疗效考核方面有一定的应用价值。

3.6包虫病

李豫青等［16］应用RIHA试验测定包虫病患者血清中总IgE水平取得较好结果，可为包虫病的临床诊断和疗效考核提供依据。

4　前景与展望

RIHA试验既可用于检测病原体的可溶性抗原，也可用于检测各种蛋白质成分。最常用的红细胞为绵羊、家兔、鸡的红细胞及O凝型人红细胞。新鲜红细胞能吸附多糖类抗原，但吸附蛋白质抗原或抗体的能力较差。致敏的新鲜红细胞保存时间短，且易变脆、溶血和污染，只能使用2～3 d。为此，一般在致敏前先将红细胞醛化。醛化红细胞具有较强的吸附蛋白质抗原或抗体的能力，可长期保存而不溶血。RIHA所需设备简单，操作简便，只需在V型96孔微量反应板上进行，结果易判定，特异性和重复性良好，有很好的实用价值，在3 h内即可做出诊断。由于RIHA具有特异性强、灵敏度高和便于操作等优点，适用于临床诊断和对少量样品的检测，易于在动物疾病诊断、生物制品研制和广大基层养殖中推广应用，具有广泛的应用前景。

参考文献：

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（责任编辑：朱迪国）

Progress on the Application of Reverse Indirect Hemagglutination Test in the Diagnosis of Animal Diseases

Zhuang Jinqiu1，2，Mei Jianguo1，2，Wang Yan1，Xie Jinwen1，Mo Ling1，Shen Zhiqiang1
（1. Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy，Binzhou，Shandong 256600；2. Binzhou Bio-carrier Biotechnology Co.，Ltd.，Binzhou，Shandong 256600）

Abstract：Reverse indirect hemagglutination test（RIHA）is a simple and practical laboratory testing technology，which has been widely used in the field of human and animal diseases and clinical detection. The progress on the application of RIHA in the diagnosis of animal virus diseases，bacterial diseases and parasitic diseases was summarized， to provide reference for clinical veterinary science and technology workers.

Key words：RIHA；diagnosis；application

中图分类号：851.3

文献标识码：A

文章编号：1005-944X（2016）06-0055-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.06.017

基金项目：山东省重点研发计划项目（2015GSF121027）；山东省现代农业产业技术体系毛皮动物创新团队项目（SDAIT-18-011-15）