HBV小鼠模型与肝脏免疫学研究进展

李凤磊　郝晓磊　田志刚

(中国科技大学免疫学研究所, 合肥230027)

·专家述评·

HBV小鼠模型与肝脏免疫学研究进展

李凤磊郝晓磊田志刚

(中国科技大学免疫学研究所, 合肥230027)

[摘要]乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus， HBV)严重威胁人类健康，免疫紊乱是主要病理学机制。由于HBV不能自然感染小鼠，研究者试图创建HBV小鼠模型，以模拟HBV的免疫病理学过程。本文将介绍各种HBV小鼠模型的构建方法，包括HBV转基因技术、HBV病毒活体肝脏靶向转染技术以及HBV自然感染人源化小鼠技术等，同时还分析了各HBV小鼠模型的优缺点、利用这些模型所解决的一系列免疫学问题，以及该领域的发展展望。

[关键词]乙型肝炎病毒；小鼠模型；转基因；人源化；病毒免疫

李凤磊(1986年-)，博士后研究员。2008年和2013年于中国科学技术大学分别获得理学学士和理学博士学位，主要从事肝脏免疫微环境和肝肠作用机制的研究。主要成果发表于Gastroenterology、J Immunol、Cell Mol Immunol等学术刊物。以第一负责人主持国家自然科学青年基金、中国博士后科学基金和中国博士后特别资助基金等。

田志刚(1956年- ),中国科学技术大学生命科学学院教授、博士生导师,现任中国科技大学生命科学学院免疫学研究所所长、中国免疫学会理事长、中国免疫学会英文会刊(Cell Mol Immunol)执行主编、中文会刊《中国免疫学杂志》主编。2001 年国家杰出青年获得者、2007 年教育部创新团队负责人、2008 和2011 年国家基金委《天然免疫与重大疾病发生发展》创新群体负责人、2008 年国家自然科学二等奖(首位)、2011 年国家科技进步二等奖(第二位)。主要从事天然免疫和肝脏免疫学研究,以通讯作者在Cell、Nat Immunol、Immunity、J Clin Invest、J Exp Med、PNAS、Nature Commun、Gastroenterology、Hepatology、J Allergy Clin Immunol、PloS Pathogen、J Hepatol等SCI 收录的国外杂志发表论文220篇。

1简介

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)HBV是一种嗜肝性病毒，全世界约有20亿人感染过HBV，其中3亿会成为慢性HBV携带者并最终发展成肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌，每年有超过60万人死于慢性HBV感染，因此HBV感染是一个严重的公共卫生问题[1]。

HBV基因组是约3.2 kb的双链松散环状DNA，包含一条完整的负义链以及部分的正义链。HBV感染肝细胞后，不稳定的rcDNA (relaxed circular DNA)会形成稳定的共价闭合环状DNA (covalently closed circular DNA， cccDNA)，cccDNA可以转录出不同长度的mRNA，进而翻译成HBV各组分蛋白，包括表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)、e抗原(Hepatitis B virus e antigen， HBeAg)、核心抗原(Hepatitis B virus core antigen， HBcAg)和X抗原(Hepatitis B virus X antigen，HBxAg)，进而包装成新的病毒颗粒释放到细胞外[2]。在HBV感染、诱导耐受以及致病的过程中免疫系统发挥着巨大的作用，因此HBV相关的免疫学研究极为重要。

1.1肝脏免疫应答肝脏是人体最大的代谢器官，也是典型的天然免疫优势器官[3]。肝脏有特殊的血供，其70%的血液由肝门静脉提供，其中富含食物抗原和肠道微生物代谢产物。动脉血与静脉血在血管壁疏松的肝窦处混合，并通过肝窦内皮细胞(LSEC, liver sinusoidal endothelial cell)与肝实质发生广泛的物质交换。肝脏中存在着大量的天然免疫细胞，包括枯否细胞(Kupffer cell)、树突状细胞(Dendritic cell， DC)、自然杀伤细胞(Natural Killer cell， NK cell)、自然杀伤T细胞(Natural Killer T cell， NKT cell)[4]；另一方面，肝脏中表达高浓度的负调性细胞因子，包括白细胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)；肝脏同时也高表达抑制性受体，比如程序性死亡配体(Programmed death ligand 1, PD-L1)以及细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)等[5]。这种独特的生理结构和免疫细胞组成使得肝脏一方面可以清除病原体，另一方面，又可对食物来源的抗原以及部分嗜肝性病毒形成耐受。

1.2HBV免疫应答的研究模型HBV宿主具有严格的种属限制，除人类外，黑猩猩和树鼩也可以被HBV病毒感染，但是黑猩猩只能形成急性的HBV感染，不能形成慢性携带[6]，树鼩模型则没有清晰的免疫学背景，无法进行免疫学研究[7]。

实验小鼠是一种成熟的免疫学研究工具，但是其不能被HBV自然感染，因此研究者通过转基因、肝脏靶向性转染和构建人源化小鼠的方法，构建了多种用于免疫学研究的HBV的小鼠模型(图1)，接下来将从模型构建和免疫学应用两个方面对其进行总结。

2HBV小鼠模型的构建历史

HBV转基因(HBV transgenic，HBV-Tg)小鼠为了研究HBV各组分蛋白在感染过程中的作用， Chisari[8]和Babinet等[9]在1985年首先构建了初代的HBV转基因小鼠，他们将HBV基因组片段加载于不同的质粒中，并通过胚胎注射将该片段与启动子序列同源重组于小鼠的基因组上，使其能够表达HBsAg和HBx蛋白。随后，HBV其他组分的转基因小鼠也相继问世[10]，例如Burk等[11]构建的HBV small S转基因鼠，Koike等[12]构建的HBx转基因鼠，Milich等[13]构建的HBeAg转基因鼠，Guidotti等[14]构建的HBcAg转基因鼠等等。Chisari等[15]在1986年构建了一种利用Alb启动子实现肝脏特异性表达HBV组分的转基因鼠，其只有肝脏高表达HBV large S蛋白。该小鼠因为其肝细胞表型变化及免疫耐受状态跟人类HBV患者相似，而被得到广泛应用[16,17]。不过随着周龄的增长，该小鼠会逐渐降低其HBsAg表达，随之其肝炎水平也会逐步下降，其机制可能和DNA甲基化相关[18]。Chisari研究组[19，20]进一步成功构建了HBV全病毒转基因鼠，重组1.3倍的HBV基因组于小鼠基因组中可以使其表达HBV的全部组分，并包装出完整的HBV病毒颗粒，该毒颗粒在电子显微镜下观察与HBV病毒颗粒无差别，且对黑猩猩具有感染性。

HBV转基因小鼠极大地促进了HBV病毒学的研究，它揭示了HBV各组分在细胞内的表达与合成途径[14]。HBV转基因小鼠是第一种建立在近交系小鼠上的模型，有清晰的免疫学背景，便于免疫机制探索和实验干预，相较于树鼩和黑猩猩模型有巨大的优势[21,22]。HBV转基因鼠在胚胎期即开始表达HBV成分并形成先天免疫耐受，实验者必须重建HBV特异性免疫应答或使获得性免疫缺陷来间接研究HBV免疫应答[23,24]。尽管如此，强免疫佐剂依然可以诱导该小鼠产生HBV特异性免疫应答，并使其HBV抗原表达降低，这对现有的T细胞选择学说是一个挑战[25]。

HBV转基因小鼠模型也有先天的不足。首先，它不能用于研究HBV病毒感染肝细胞的过程；其次，cccDNA对HBV慢性携带状态的形成至关重要[26]，但HBV转基因小鼠不具有cccDNA，不能用于研究cccDNA与免疫系统的相互作用。

2.1高压注射介导的HBV携带小鼠为了解决HBV转基因鼠对HBV中枢耐受的问题，使小鼠在成年期携带HBV的模型被逐渐建立。Feitelson等[27]首先将3.2 kb的HBV基因组直接肝内注射给获得性免疫缺陷的Nude小鼠，在小鼠血清中观察到长达7个月的HBsAg表达，然而因为免疫缺陷，Nude小鼠不能用于免疫学研究。

Chisari研究组[28,29]尝试用高压注射的方法将pT-MCS-HBV1.3质粒导入小鼠肝脏，该质粒只能在正常小鼠体内存在7 d，而获得性免疫缺陷的NOD-SCID小鼠则可以维持HBV1.3表达长达60 d，这说明免疫系统会限制该质粒在成年小鼠肝脏中的表达。

陈定信研究组[30]在2006年换用了不同的质粒骨架，构建了pAAV-HBV1.2高压注射小鼠模型， 60%的C57BL/6小鼠可以维持表达该质粒超过20周，而BALB/c小鼠则不能形成携带，替换载体骨架也不能形成HBV长期表达，说明机体免疫状态和载体效应共同决定着HBV载体的表达。

小鼠体内无法自然形成HBV cccDNA，蓝柯研究组[31]用高压注射的方法将loxP-Cre系统导入到小鼠肝脏，并剪接出rcccDNA以模拟HBV病毒的持续携带。可是，经过剪切的rcccDNA中仍有残留的loxP位点，进而导致HBV聚合酶和 Large S蛋白不能正常转录翻译，因此HBV-cccDNA模型小鼠还需要进一步优化。

高压注射方法构建的HBV小鼠模型容易操作，可以利用不同的质粒骨架诱导急性的HBV排斥和慢性HBV耐受，后者也非常适合用于抗HBV药物的筛选[32]。然而，高压注射模型诱导的免疫应答多是针对载体本身而不是HBV，并且该模型不能模拟HBV自然感染过程且感染效率低(约5%~10%)，从而限制了其研究的意义。

2.2载体介导的HBV携带小鼠为了提高HBV感染小鼠的效率，腺病毒载体(Adenovirus, Ad)和腺相关病毒载体(Adenovirus associated virus，AAV)被用来将HBV基因组带入到肝实质细胞内表达，从而形成了载体介导的HBV携带小鼠[33]。

Protzer教授研究组[34]首先运用加载了1.3倍HBV基因组的腺病毒尾静脉感染小鼠，1×109i.u高剂量感染使小鼠持续表达HBV病毒蛋白组分长达2个月，并伴随着高滴度的HBV DNA。而1×108i.u的低剂量腺病毒更可诱导长达100 d以上的HBV持续感染(HBsAg，HBeAg滴度均持续高于100 U/ml)，且不引起体内抗表面抗原抗体(anti-HBs)的产生[35]。类似的，腺相关病毒也可将HBV基因组导入成年小鼠肝脏，并诱导慢性HBV携带及HBsAg和HBeAg持续性高表达[36, 37]。近来，AAV8也被成功用于1.2 kb HBV基因组的转染，其成功诱导小鼠产生长达6个月的HBV抗原，尤为重要的是，该模型小鼠可自然产生肝纤维化并伴随胶原沉积和TGF-β上调[38]。值得注意的是，腺病毒载体还可以激活免疫系统，非复制型腺病毒作为载体表达HBV核心蛋白及修饰后的聚合酶，成功激活了HBV耐受小鼠的HBV特异性的T细胞免疫应答[39]。因此，载体介导的HBV肝脏靶向转染模型中的免疫应答大多也是由载体本身决定，这仍旧限制着免疫学研究的深入。

2.3肝脏人源化小鼠常规HBV小鼠模型由于种属限制性，仍然不具有HBV感染过程、cccDNA的形成以及HBV的扩散等。最合适的HBV研究靶标仍旧是人肝实质细胞，但是人原代肝实质细胞在体外培养过程中会逐渐丢失HBV的受体钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)而无法再被HBV感染[40]。因此，研究人员尝试将人的肝实质细胞移植入小鼠体内，以使人其维持正常的生理活性，然后再被HBV体内感染。

Ilan等[41]首先对SCID小鼠重建小鼠免疫系统，后将HBV病毒感染过人肝组织移植到该小鼠的肾包膜下，构建成了第一个人源化肝脏的HBV小鼠模型，该模型中HBV可以持续存在约20 d，但是滴度非常低。

近年来，肝脏替代的人源化小鼠模型得到了飞快的发展，三种肝脏自发或者被诱导凋亡的小鼠模型陆续被构建。其中应用最广泛的是uPA/SCID小鼠，该小鼠是在肝脏特异性Alb启动子下表达uPA基因，造成小鼠肝细胞的自发死亡[42]。uPA小鼠与SCID小鼠杂交后获得T/B细胞缺失的uPA/SCID小鼠以便于外源的人肝细胞的植入[43]。uPA转基因小鼠的繁育比较困难，技术要求高，因此邓宏魁研究组[44]利用Tet on系统构建了Ad.TRE-uPA/SCID小鼠，实现了可控的肝脏死亡，优化了uPA小鼠系统。延胡索二酰乙酰乙酸水解酶(Fumarylacetoace-tate hydrolase，Fah)是酪氨酸代谢途径中的关键酶，Fah缺陷会导致代谢产物在肝细胞中积累，引发小鼠肝细胞的死亡[45]。Azuma等[46]将Fah缺陷鼠与Rag2-/-γc-/-鼠杂交后获得免疫系统重度缺陷的FRG缺陷鼠，人来源的肝细胞在其中达到了80%以上的高比例重建。在肝脏人源化FRG小鼠中，HBV感染效率高达50%~80%，宿主肝细胞呈现HBcAg和Fah双阳性[47]。TK-NOG模型是在NOD/SCID/γc-/-小鼠中转入Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)，这种小鼠在无毒性剂量的GCV作用下会自发肝细胞的死亡，为人源化细胞的植入腾出了空间[48]。TK-NOG人源小鼠也可以构建出高比例的人源化肝脏，并使HBV在小鼠体内完成完整的生命周期，以用于科学研究与药物测试[49]。以上模型小鼠均不具有人免疫系统，因此研究者尝试利用肝脏和免疫系统双人源化来解决这一问题[50-52]。双人源化小鼠模型已经获得了初步的成果，对NOG小鼠同时转输HBV感染的人肝实质细胞和人HBV特异性的CTL细胞，成功诱导出HBV特异性的肝炎模型，并用于人免疫耐受机制的研究[53]。

肝脏人源化小鼠模型相较于其他的小鼠模型有明显的优势，即其有完整的HBV感染和复制的过程，该模型现在已用于固有免疫系统抗HBV功能的研究以及高亲和力抗体的筛选[54，55]，但是其系统构建过于复杂且不稳定。人肝实质细胞的来源是其限制因素之一，而iPS诱导成肝细胞的研究为该问题提供了解决思路[56]。虽然人源化小鼠的肝实质细胞来源于人类，但是其他参与HBV疾病进程的细胞，比如Kupffer细胞、肝窦内皮细胞、星形细胞等，依然无法被人源化取代，这也限制了其科学意义。

3基于HBV小鼠模型的免疫学研究

3.1免疫防御免疫系统对HBV的防御作用直接体现于HBV高压注射模型中，正常小鼠在注射HBV DNA后会在 2~3周内会彻底清除HBV；但是获得性免疫细胞和NK细胞缺陷的小鼠可以被HBV持续感染长达81 d[28]。

天然免疫系统中抗HBV免疫应答最典型的代表是Ⅰ型干扰素家族。IFN-α与其受体结合以后会活化胞内Jak/Stat途径，进而启动下游一系列干扰素刺激基因(IFN-stimulated gene，ISG)的转录表达，ISG可以限制胞内病毒的复制。对Upa/scid/beige小鼠进行长期的IFN-α处理，可以诱导其ISG表达持续增强，并最终导致HBsAg和HBeAg表达的显著下调[57]。在体外培养体系和人源化小鼠的研究发现IFN-α还可以通过表观遗传学的机制抑制HBV复制，IFN-α会促进与cccDNA结合的组蛋白的低乙酰化，并且招募转录共抑制子结合cccDNA，进而抑制HBV的复制[58]。对人源化小鼠注射病毒类似物发现，小鼠和人的肝实质细胞对干扰素的反应性并不同，人肝实质细胞表达更高水平的IFN-λ，而表达低水平的IFN-α和IFN-β[59]，这也暗示HBV感染过程的物种差异性。

获得性免疫系统在抗HBV免疫应答中也发挥着至关重要的作用。细胞毒性T细胞(Cytotoxic lymphocyte，CTL)一般通过裂解杀伤被病毒感染的细胞的方式清除病毒，但是有趣的是CTL细胞却通过一种非细胞毒性依赖的方式清除HBV病毒[60-62]。HBV特异性CTL转输可以有效清除HBV转基因小鼠的HBV表达，但是其并不引起肝细胞死亡，而是通过分泌IFN-γ和TNF-α来影响HBV RNA结合蛋白的稳定性，进而达到抑制HBV复制的目的[63]。腺病毒载体介导的HBV载体急性感染小鼠后7 d，血清中抗体产生而病毒组分消失，这直接说明了体液免疫应答也同样发挥着抗HBV的作用[28]。

3.2免疫耐受HBV在免疫系统的多个层面上诱导免疫耐受[64]。对HBV感染的肝脏人源化小鼠进行IFN-α注射，8~12 h后HBV RNA下调，但是24 h后其又上调。与未感染组相比，HBV感染的肝细胞胞内ISG，MyD88和TAO-1表达均下调，进一步的研究表明IFN-α在HBV感染的肝细胞内不能够诱导STAT-1的核内转运，说明HBV直接抑制肝实质细胞IFN-α信号[65, 66]。最近我们研究组发现，HBV感染会上调miRNA146a的表达，而其在HBx抑制IFN-α信号的过程中发挥着重要作用[67]。因此，我们设计了一种小干扰RNA来阻断HBx对IFN-α的抑制[68]，其在体内外均展示出强大的打破HBV免疫耐受的能力。HBV转基因小鼠肝实质细胞MHC-I分子表达下调，这进一步降低CTL和NK细胞对其识别杀伤作用，进而造成免疫耐受[69]。最新研究表明HBV感染的肝实质细胞表达凋亡蛋白抑制剂，从而抑制其自身凋亡而增强HBV耐受[70]，而利用拮抗剂阻断这一过程可以显著地清除HBV[71]。

HBV还可诱导获得性免疫耐受，近年来随着一种高压注射PAAV/HBV1.2质粒介导的慢性HBV携带小鼠模型的出现，该领域取得了迅速的发展[30]。我们研究组首先对其免疫系统进行了研究，发现该HBV携带小鼠表现出与成年人类一致的感染和预免疫现象，即预先接受HBsAg疫苗免疫的小鼠可以抵抗HBV的慢性感染，但是如果先被HBV慢性感染，小鼠则对外周疫苗免疫无应答并形成HBV的长期携带，机制研究发现这种体液免疫耐受与Kupffer细胞以及IL-10有关，Kupffer细胞或IL-10缺陷会打破该耐受[72]。有趣的是，Kupffer细胞TLR2受体可以直接接识别HBcAg，并被诱导产生IL-10[73]。之后Kupffer细胞会进一步诱导肝脏Ⅰ型调节性T细胞(Type 1 regulatory T cell，Tr1 cell)产生IL-10，后者会迁移到引流淋巴结抑制Tfh和生发中心(Germinal center，GC)B细胞反应，最终导致生发中心不能形成而阻断体液免疫应答[74]。这种IL-10依赖的负调作用是非常广泛的，借助于该模型发现IL-10还可以直接促进NK细胞上调表达抑制性受体NKG2A，从而使NK细胞抗病毒功能下调，促进HBV免疫耐受[75]。Kupffer细胞诱导HBV免疫耐受的机制是多样的，最新的研究表明F4/80+CD206+CD80low/+的独特巨噬细胞亚群可以通过分泌双调蛋白促进肝脏Treg的抑制功能[76]。γδT细胞在HBV耐受过程中也发挥着重要作用，研究表明γδT细胞会通过分泌IL-17招募骨髓来源的抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSC)进入肝脏，后者会抑制CTL细胞的功能，进而增强HBV免疫耐受[77]。有趣的是HBsAg在体外也可以直接促进外周血中单核细胞转化为MDSC，这一过程主要通过ERK/IL-6/STAT3信号途径实现[78]。针对HBV感染导致的CTL功能耗竭以及免疫负调，我们设计了一种同时包含免疫激活序列和干扰HBx序列的载体，其展示出高效的打破免疫耐受的功能[79]。

总之，HBV借助于自身的病毒组分以及肝脏免疫负调微环境在抗病毒免疫的各个环节阻击免疫反应，促进免疫耐受。

3.3免疫反应介导的肝脏疾病肝炎：HBV转基因小鼠虽然表达HBV各组分，但是并没有发生肝细胞损伤，这暗示HBV病毒本身并不会导致肝细胞死亡，其相关的病理损伤可能是由免疫系统导致[80]。的确如此，给HBV转基因小鼠转输HBV特异性的CTL会导致其发生急性肝炎和肝细胞损伤[23]。CTL一方面通过细胞因子依赖的非细胞毒性的方式排斥HBV感染[60, 63]，另一方面，CTL还会招募其他非HBV特异性的炎性细胞诱导肝损伤[81]。

为了研究天然免疫细胞在HBV相关的肝损伤中的作用，多种免疫刺激剂被应用到HBV转基因小鼠体内以激活相应免疫细胞。我们研究组[82]发现，TLR3(Toll like receptor 3)激动剂Poly I:C能够促使HBV转基因小鼠产生更强的肝损伤，表现为增高的血清谷丙转氨酶(Alanine transaminase， ALT)水平以及更加严重的肝脏炎症病理。HBV转基因小鼠对Poly I:C的易感性依赖于肝脏NK细胞分泌的IFN-γ，同时也发现HBV转基因小鼠肝实质细胞在poly I:C刺激后会上调表达更多的IFN-γ受体。低剂量ConA注射也会诱导HBV转基因小鼠产生爆发性肝炎，ConA刺激会导致NKG2D配体Rae-1和Mult-1在HBV小鼠肝实质细胞中大量表达，两者进而通过NKG2D活化NK细胞，导致NK细胞介导的肝炎发生[16]，相应的，HBV转基因小鼠具有特有的免疫负反馈机制，其肝脏Treg细胞通过表达模型的TGF-β和OX40来抑制NK细胞的过度活化[83]。肝再生是一个免疫系统参与的过程，HBV转基因小鼠小鼠表现出明显低下的肝再生能力。肝切除手术之后，HBV转基因小鼠肝脏会大量聚集活化的NKT细胞抑制肝再生，当阻断CD1d-NKT的交互作用后，其肝再生能力得到恢复[84]。

免疫系统攻击导致肝炎在人源化小鼠中也得到了验证。对uPA/SCID人源化小鼠构建人肝实质细胞后，对其转输半相合的PBMC细胞，随之则发现了明显的人免疫细胞的侵润和NK细胞介导的肝细胞再生受损，而当对其注射anti-Fas抗体或者清除DC细胞后可以显著抑制人肝实质细胞的死亡[85]。肝脏人源化小鼠感染HBV后会大量表达NK细胞依赖的Ifng基因，并导致肝实质细胞甲基化基因大量增多，而这些甲基化基因和肝细胞坏死及肝癌相关[86]。

3.4肝纤维化HBV转基因小鼠自发产生肝纤维化，CCL4会加速此进程的发生，机制研究表明HBV转基因小鼠NKT细胞过度活化并释放细胞因子IL-4和IL-13，后者会活化肝脏星形细胞(Hepatic stellate cell，HSC)，并最终导致胶原沉积和肝纤维化[87]。最新研究则表明TGF-β-CD147正反馈途径在此过程中也发挥着重要的作用，TGF-β通过Smad2、Smad3和Smad4上调CD147表达，而CD147则可以通过ERK1/2和Sp1上调HSC表达α-SMA、胶原酶-I以及TGF-β[88]。IL-22也参与该过程，在HBV转基因小鼠中，阻断IL-22信号可以显著降低CXCL10和CCL20的表达，进而降低Th17细胞的招募，降低肝脏炎症和纤维化的发生[89]。

HBV诱导肝纤维化的进程和机制在人源化小鼠中也得到了进一步的验证和解析。对免疫缺陷的A2/NSG小鼠同时重建人造血干细胞和肝细胞，即A2/NSG-hu HSC/Hep小鼠，HBV感染该小鼠成功模拟出了人类的免疫反应、慢性肝炎以及肝纤维化[90]。该人源化小鼠肝纤维化中观察到了大量的人类M2型巨噬细胞，而基因分析发现后者与人类HBV患者肝纤维化和肝坏死相关[90]。

3.5肝癌免疫反应会诱导HBV相关的肝癌。最典型的证据是Chisari研究组1998年基于HBV转基因小鼠进行的免疫系统重建的模型。对HBV转基因小鼠(lineage 107-5)进行胸腺摘除和辐照处理以破坏其对HBV耐受的免疫系统，然后再对该小鼠进行正常小鼠来源的骨髓重建，同时转输HBsAg疫苗免疫过的正常小鼠的脾脏细胞，该细胞进入HBV转基因鼠体内后会持续攻击HBV表达的肝实质细胞，形成持续的肝炎和肝纤维化，并最终在17个月后全部发展成肝癌[91]。在HBV特异性CTL细胞招募到肝脏的过程中，血小板发挥着重要的作用，利用阿司匹林和氯吡格雷抑制血小板，可以显著地降低肝脏中HBV特异性CTL细胞的数量，进而降低肝炎、肝纤维化和肝癌的发生[92]。事实上，非特异性的免疫攻击也可以导致HBV相关的癌症，CD137是CTL细胞表面重要的共刺激受体，CD137激活抗体可以显著活化HBV转基因小鼠中非特异性的CTL细胞分泌IFN-γ，进而激活Kupffer细胞产生TNF-α,IL-6和MCP-1促进肝硬化和肝癌的发生[93]。虽然炎癌变过程中肝细胞内的信号途径还不是很清楚，但是有证据表明炎性信号可能诱导了肝细胞上调表达转录因子c-JUN/AP-1进而促进肝细胞成瘤[94]。

4展望

HBV特异性细胞受体NTCP的发现为HBV小鼠模型的建立提供了新的契机。李文辉课题组[95]发现HBV preS1肽段可以特异性地与NTCP结合，后者在人类原代肝实质细胞中大量表达。借助于这一理论突破，转染了NTCP的人肝癌细胞系能够成功地被HBV感染，NTCP转染的小鼠肝实质细胞仍然不能够被HBV感染[96,97]。研究表明这种限制可能发生在病毒进入细胞以后和病毒转录之前的阶段，而这可能和一些特定的仅存在于人类肝实质细胞而不存在于鼠类肝实质细胞中的因子有关[98]。表达人NTPC的小鼠细胞系不能被HBV感染，但是和人肝癌细胞系HepG2融合后的小鼠细胞系均可被HBV感染，另一方面对小鼠细胞系导入cccDNA模拟分子也可以使后者成功表达HBV相关基因，这些实验充分说明小鼠细胞系缺少人类肝细胞独有的位于cccDNA上游的某个分子[99]。虽然该领域的研究目前进入了瓶颈状态，但是毫无疑问，该领域的突破会解释更多的HBV感染和致病机制，也会为新的模型的构建提供理论基础。

虽然人源化小鼠可以成功构建人的肝实质细胞，但是其他的非实质细胞，包括LSEC、Kupffer细胞和HSC细胞很难被人源化取代。而HBV相关的病理性过程，包括肝炎、肝纤维化以及肝癌都需要肝实质细胞和其他肝脏驻留细胞的交互作用实现，因此目前的人源化小鼠还很难重建人类HBV相关的疾病。目前的人源化小鼠多是基于免疫缺陷小鼠构建，他们也不适合获得性免疫特别是疫苗免疫学的研究。因此，肝脏免疫系统双人源化小鼠需要进一步优化，肝细胞的取代率、病毒的感染效率以及其他组织细胞的取代都需要提高；此外，回归基于小鼠本身免疫系统和组织细胞的研究，优化成年小鼠HBV后天感染方案。

HBV小鼠模型最初多是由病毒学家构建用以解决病毒学问题，所以，对现有的HBV小鼠模型的新的深入的免疫学解读也非常重要。比如，在临床上已经观察到HBx和HBV相关的肿瘤发生有着密切的关联[100]。之后这种现象在HBx转基因鼠中也得到了验证，HBx小鼠会被DDC饮食处理诱导产生肝癌[101]。有趣的是，在该肿瘤模型诱导过程中同时发现了一系列的免疫学变化，包括血清IL-6的上调和STAT3活化等，但是这些免疫反应在HBV相关肿瘤诱导过程中的具体作用还不清楚。因此，对已有HBV小鼠模型的免疫学的再分析会推动该领域的发展。

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[收稿2016-01-08]

(编辑许四平)

Research advances of HBV mouse model and liver immunology

LIFeng-Lei,HAOXiao-Lei,TIANZhi-Gang.InstituteofImmunology,USTC,Hefei230027,China

[Abstract]Hepatitis B virus (HBV) threatens human's health seriously, immune disorder is the main pathogenesis.HBV cannot naturally infect mouse liver, thus the researchers tried to established HBV mouse models to imitate the immunological pathogenesis of HBV infection.This review summarize various methods to establish HBV mouse models, including HBV transgenic technics, HBV in vivo liver-target transfection technics and HBV naturally infected humanized mouse technics etc.Their advantages, disadvantages and contributions to immunological studies were also analyzed, and the development of this area was also prospected.

[Key words]Hepatitis B virus;Mouse model;Transgenic;Humanized mouse;Viral immunology

中图分类号R392

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)02-0145-09

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.001