TLR4与β2GPI/抗β2GPI复合物在动脉粥样硬化中的作用研究①

TLR4与β2GPI/抗β2GPI复合物在动脉粥样硬化中的作用研究①

王婷周红

(江苏大学医学院，镇江212013)

①本文为国家自然科学基金资助项目 (No.81370614)。

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)所引起的血栓形成及心血管疾病是目前全世界导致人类死亡的主要原因，对人类的生存和生活质量是一种巨大的威胁和破坏。弗雷明汉研究提出了一系列动脉粥样硬化的危险因素，例如高胆固醇血症、高血压、吸烟、肥胖和家族史等，但这些危险因素已不足以解释该病的发生发展，有关AS的自身免疫因素越来越受到关注。自身免疫性疾病如抗磷脂综合征(Antiphospholipid syndrome，APS)、系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)通常伴随有AS的发生，患者由未成熟或加速发展的动脉粥样硬化斑块而引发心血管事件的发病率和死亡率越来越高，甚至远远超过疾病本身及感染等其他并发症。本文对TLR4与β2GPI/抗β2GPI复合物在动脉粥样硬化中的研究进行综述，以期对AS的病理机制有更好的理解，为其临床治疗提供新思路。

1β2GPI/抗β2GPI复合物与oxLDL

1.1β2GPI/抗β2GPI复合物β2糖蛋白I(β2- glycoprotein I，β2GPI)，1961年由Schule等学者首次报道，该蛋白是一种分子量约为50 kD的血浆糖蛋白，在血浆中β2GPI参与组成乳糜微粒、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白等,并参与脂肪的代谢和转运，故也称载脂蛋白H。研究发现β2GPI及其抗体复合物在APS、糖尿病动脉粥样硬化、血管新生过程中发挥着重要作用。APS患者体内存在高滴度的抗磷脂抗体(antiphospholipid antibody，aPL)，其中抗β2GPI抗体是患者体内最重要的aPL，表明β2GPI是其主要的靶抗原。APS是获得性血栓形成倾向的重要原因之一。研究表明β2GPI/抗β2GPI复合物可刺激血液单核细胞、血小板、血管内皮细胞等，促进组织因子(Tissue factor,TF)、炎症分子及黏附分子等表达增加[1，2]，从而参与APS高凝状态与血栓的形成。对伴随有AS的系统性自身免疫性疾病如APS的研究表明，β2GPI和抗β2GPI抗体在AS的发生发展中也至关重要：很大一部分伴随有AS的APS和SLE患者体内有β2GPI特异性T细胞(β2GPI-specific T cell)的活性，证实在亚临床AS中β2GPI有连接自身免疫应答和内皮功能失调的作[3]；在对外周动脉疾病的动脉粥样硬化的发生机制研究中，发现实验组中循环流动的抗β2GPI抗体滴度明显增高，说明抗β2GPI抗体参与了AS的形成[4]。但是β2GPI和抗β2GPI抗体是否以β2GPI/抗β2GPI复合物的形式在AS发生发展中发挥作用及其具体的作用机制尚未清楚，仍待研究。

1.2oxLDL/β2GPI复合物血浆中的天然低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)主要由胆固醇、甘油三酯、磷脂和蛋白质等组成，LDL是血液中胆固醇的主要载体。有报道LDL只有在首先氧化修饰成氧化低密度脂蛋白(oxidized-low density lipoprotein，oxLDL)后才能进一步与多种血浆蛋白如β2GPI等发生相互作用诱导泡沫细胞和动脉粥样斑块的形成。与AS形成有关的危险因素中，高水平的LDL是最重要的危险因素，并且氧化性低密度脂蛋白比天然LDL危害更大。oxLDL一直都被认为是AS这类心血管疾病的危险信号之一，oxLDL与脂质结合血浆蛋白β2GPI相互作用形成的oxLDL/β2GPI复合物被认为是致动脉粥样硬化的自身抗原，从oxLDL中提取的脂质包含β2GPI特异性结合的配体，定义为oxLig-1(7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate)和oxLig-2[7-ketocholesteryl-12-carb-oxy(keto) dodecanoate]。oxLDL和β2GPI的结合主要分为两个阶段，首先oxLDL上的脂质配体(主要是oxLig-1)通过静电引力非共价结合形成不稳定的中间复合物，随后转化为共价结合的不易解离的稳定型复合物。

因为血管内膜的微环境有助于进一步的炎症、氧化、细胞活化以及巨噬细胞对oxLDL/β2GPI复合物的吞噬等，所以β2GPI与oxLDL的结合很有可能发生在血管壁内部。在体外实验中发现oxLDL/β2GPI复合物通过促进巨噬细胞对oxLDL摄取来加剧动脉内膜壁的炎症性损伤，诱导巨噬细胞的泡沫化，发挥其致动脉粥样硬化斑块形成的作用[5]。不仅在自身免疫性疾病如APS和SLE中，在许多慢性炎症性疾病如糖尿病、慢性肾病的病人中也发现稳定型循环oxLDL/β2GPI复合物，说明oxLDL/β2GPI复合体主要有两种功能：(1)作为一种促进巨噬细胞摄取和脂肪细胞形成的代谢形式；(2)作为一种致动脉粥样硬化的抗原。

研究发现，在自身免疫性疾病如APS、SLE并发AS的患者中有明显的抗oxLDL/β2GPI抗体的存在，主要包括IgG和IgM型，IgG型很可能导致SLE患者增加发生心血管疾病的风险[6]。临床研究表明，动脉疾病和自发性静脉疾病的患者的IgG型抗oxLDL/β2GPI自身抗体与oxLDL/β2GPI复合物水平明显升高，IgG型抗oxLDL/β2GPI自身抗体加强了巨噬细胞摄取oxLDL/β2GPI复合物的能力，促进了oxLDL的内化作用并加速泡沫细胞的形成，成为血栓和AS形成的风险因素[7]。抗oxLDL/β2GPI抗体和oxLDL/β2GPI的同时存在，提示存在这两种成份交互作用形成循环免疫复合物(oxLDL/β2GPI/抗体)的可能性，循环免疫复合物(包括oxLDL和β2GPI在内)的出现不仅说明自身抗体在AS形成中发挥着一定作用，在自身免疫介导的心血管并发症中发挥着一种促炎和促栓的作用，而且表明系统性自身免疫疾病的患者有发生AS的倾向，这也为自身免疫疾病患者斑块形成的加速(或不成熟)提供一个合理的解释。

1.3oxLDL/β2GPI/抗β2GPI复合物在系统性自身免疫性疾病如APS并发AS的患者中有明显的抗oxLDL/β2GPI抗体的存在，并且抗β2GPI抗体是抗磷脂综合征患者体内最重要的aPL，但oxLDL/β2GPI复合物与抗β2GPI抗体之间的关系罕见报道。体外实验中，受oxLDL/β2GPI复合物和抗β2GPI抗体共同刺激的巨噬细胞可表达清道夫受体(Scavenger receptor，SR)CD36和IgG Fc 段受体(FcγR)[8]，表明巨噬细胞一定程度上是通过针对oxLDL/β2GPI/抗β2GPI免疫复合物，经FcγR和SR的调节作用摄取oxLDL/β2GPI复合物。研究小组前期的研究表明：oxLDL/β2GPI/抗β2GPI复合物可以通过TLR4/NF-κB信号转导通路对动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞泡沫化的形成有显著的促进作用，该复合物可以在巨噬细胞的泡沫化过程中上调细胞表面TLR4的表达,使TF表达增加[9]，可见oxLDL/β2GPI/抗β2GPI复合物对动脉硬化中粥样斑块和血栓的形成和发展都有一定的促进作用。深入研究oxLDL/β2GPI/抗β2GPI复合物在动脉粥样硬化发病机制中的作用，对进一步理解自身免疫背景下的AS产生机制、如何将其应用于临床预防和治疗均具重要意义。

2TLR4

2.1TLR4概述TLR4(Toll like receptors 4)属于模式识别受体(Pathogen recognition receptors，PRR)，主要识别由细菌、病毒、真菌等病原微生物表达的具有保守基序的病原相关模式分子(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)。TLR4 是第一个被认识的人类TLR，也是研究最多和最具特性的 TLR，属于Ⅰ型跨膜糖蛋白(Type Ⅰ transmembrane glycoprotein)，由富含亮氨酸的重复基序(Leucine-rich repeat，LRR)的胞外区、富含半胱氨酸的跨膜区和含有TIR同源区(TLR/IL-1R homologous region)的胞内信号区三部分组成。TLR4的内源性配体包括热休克蛋白(HSP60)、纤维结合蛋白、肝素、透明质酸、纤维蛋白原及oxLDL和最近报道的微氧化 LDL (minimally oxidized LDL,m mlDL)[10]，主要表达于与宿主防御有关的细胞表面，如单核巨噬细胞、树突状细胞。TLR4在不同的炎症损伤条件下，例如其经典配体LPS诱导时，作为一种膜表面信号转导分子启动细胞内信号转导，激活细胞参与反应。

TLR4有两个重要的结构域，胞外的LRR结构域和胞内的TIR结构域，TLR4与配体结合后发生二聚化，结构发生改变并募集下游信号蛋白MyD88、MAL、TRIF或TRAM等，介导两种不同的信号通路：MyD88依赖性信号转导和MyD88非依赖性信号转导。TLR4通过上调转录因子NF-κB、干扰素调节因子(Interferon regulatory factor 3，IRF3)或活化激活蛋白-1(Activator protein，AP-1)来诱导细胞因子和黏附分子等基因的表达[11]。

2.2TLR4与AS众所周知，慢性炎症是动脉粥样硬化发病过程中的关键机制，近期研究表明，先天性免疫和炎症过程的交互作用一定程度上也促进了血管损伤的发展，TLR4是Toll样受体中最典型的形式，发挥着先天性免疫、炎症、动脉粥样硬化之间桥梁的作用。1984年，Yamamoto[12]最先对巨噬细胞上的LDL受体进行描述，在动脉粥样硬化发展过程中，这些受体表达下调来防止脂质过负荷。随后，另一种巨噬细胞表面化学修饰的LDL受体被发现并命名为清道夫受体。清道夫受体和Fcγ受体是巨噬细胞对oxLDL和oxLDL/β2GPI复合物进行胞吞作用的主要受体，然而，利用免疫组织化学对人及小鼠动脉粥样硬化模型的组织切片进行染色，结果发现TLR4在动脉粥样斑块组织特别是巨噬细胞浸润的部位显著性高表达[13]，体外实验发现：在oxLDL存在的条件下，巨噬细胞表面的TLR4表达明显上调[14]，可见TLR4在斑块的形成过程中也发挥一定的作用。在TLR4基因缺陷的ApoE-/-小鼠模型中，也早已证实TLR4在粥样斑块的触发形成和发展过程中的关键作用，ApoE-/-小鼠模型斑块体积明显减小，斑块内的脂质和巨噬细胞浸润均降低，促炎因子表达显著降低，这使得斑块稳定而不易破裂，故推测TLR4可能引起一系列信号级联反应，诱发相关炎症因子的表达，参与不稳定性斑块形成[15]。

近期研究发现溶血磷脂胆碱(Lysophosph-atidylcholine，LPC)作为oxLDL主要的磷脂成份可以通过TLR4信号通路，上调巨噬细胞中NF-κB和IL-8的产生来诱导经典的促炎症表型的表达[16]，另一实验组的研究人员发现在TLR4/NF-κB信号通路中，MAPK的磷酸化可触发下游信号蛋白的活化，可激活核因子(NF-κB)的转位，最终导致粥样斑块的进展和断裂，MAPK的激活对MCP-1的分泌至关重要，对单核细胞在动脉损伤部位的募集有调控作用[17]。同时有研究认为是巨噬细胞胞内的TLR4在斑块的形成中发挥作用，对LDLR-/-小鼠进行骨髓移植，使其产生TRAM、TRIF、MAL的造血性缺陷，并给小鼠喂高脂饮食后处死，结果发现TRIF和TRAM的缺陷对粥样斑块的大小和炎症因子、趋化因子的分泌等都有明显的减弱作用，而MAL的缺陷并没有显著的改变。在细胞内，TLR4以TRAM作为桥梁间接招募TRIF，而TLR4在细胞表面和MyD88的结合需要MAL的协助。MAL和TRIF、TRAM间的差异提示由TRIF和TRAM诱导产生的干扰素调节因子3(Interferon regulatory factor，IRF3)是重要的调节促动脉粥样硬化的信号[18]。转录因子IRF3诱导产生的Ⅰ型IFN有在动脉损伤部位募集巨噬细胞的作用[19]，进一步证实了这个猜测。但究竟是细胞表面还是胞内的TLR4(或者共同参与)在AS的发病机制中发挥作用仍存在一定的争议，尚未达成共识。

2.3TLR4与AS病理进程中的相关细胞

2.3.1单核巨噬细胞动脉粥样斑块的主要特征包括动脉壁脂质沉积和免疫细胞浸润，而巨噬细胞是最先侵入动脉粥样斑块损伤部位的炎性细胞，并且是最终形成斑块的主要成分，在AS各个阶段都发挥着核心作用。AS早期，LDL聚集在血管内膜，激活内皮细胞表达白细胞黏附分子和趋化因子，促进单核细胞和T细胞募集。

巨噬细胞相关生物大分子不仅在AS发生发展中起重要作用，同时其表达量的高低也与AS病理发展的进程密切相关。本实验组研究发现，在oxLDL/β2GPI或oxLDL/β2GPI/抗β2GPI复合物存在的条件下，巨噬细胞表面的TLR4与其配体结合后，通过TLR4/NF-κB信号转导可以上调单核细胞趋化蛋白(MCP-1)的分泌、增加磷酸化NF-κB的产生和巨噬细胞内的脂质负荷，巨噬细胞表达TF也明显上升，通过油红染色发现泡沫化的巨噬细胞增加，提示TLR4/NF-κB通路一定程度上对抗磷脂综合征患者的动脉粥样硬化的发生发展进行调控[9]。用KLA(一种特异性的TLR4激动剂，Kdo2-Lipid A)刺激THP-1细胞，进一步证实了TLR4介导的单核细胞中Mac-1的表达在单核细胞与血管内皮细胞的黏附中发挥关键性作用[20]。巨噬细胞经TLR4介导产生肿瘤坏死因子α(TNF-α)，并且通过TNF受体与TNF-α相互作用，TNF-α被认为是巨噬细胞分泌的主要的促炎细胞因子之一[21]，TNF-α的表达增加可促进活性氧自由基(Reactive oxide species，ROS)产生，导致内皮功能紊乱。近期也有研究证实类肝素可通过TLR4上调TNF-α、MMP-9、IL-1、 IL-8和 MCP-1等炎症因子的表达，激活动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞[22]。

微氧化低密度脂蛋白(m mlDL)也可诱导巨噬细胞的炎症性反应，包括胞饮作用的加强和细胞内脂质的聚集。而氧化胆固醇酯(Oxidized cholesterol esters，OxCEs)作为m mlDL的主要生物活性成份，可诱导TLR4/MD-2的结合与TLR4的二聚化，ERK1/2、JNK、c-Jun的磷酸化，加强的巨噬细胞胞饮作用，最终导致细胞内脂质聚集的增加和泡沫细胞的形成[23]。

2.3.2内皮细胞血管内皮细胞与动脉粥样硬化之间关系十分密切,目前普遍被接受的学说是Ross的修正“损伤反应”学说，该学说认为内皮细胞的功能性损伤是动脉粥样硬化形成早期的始动环节，并且血管内皮细胞功能相关的生物活性物质也影响动脉粥样硬化的发生发展，主要包括两类:一类是舒缩血管的活性物质，一类是介导血细胞与内皮细胞之间黏附的趋化因子和黏附分子。在体外实验中，利用TLR4的拮抗剂依立托仑(eritoran)对人主动脉内皮细胞(Human aortic endothelial cells，HAECs)进行预处理，可以抑制TLR4经典配体LPS诱导的炎症性细胞因子(如：IL-6、IL-8、TNF-α、CCL-2)和黏附分子(如：ICAM、VCAM)的表达，同时也抑制NF-κB p65和IκB-α的磷酸化，表明TLR4通过NF-κB 依赖的信号通路诱导人类大血管内皮细胞的活化，促进调控炎症因子和黏附分子产生的基因的表达，从而在动脉粥样硬化的血管炎症中发挥作用[24]。但与之矛盾的是另一研究组发现：与大血管内皮细胞相比，微血管内皮细胞由于有更高的TLR4和CD14的表达和与之对应的更强的TLR4介导的NF-κB的活性，所以细胞因子、趋化因子、生长因子和黏附分子等都有明显的更高表达[25]。所以大血管内皮细胞和微血管内皮细胞在AS发病机制TLR4/NF-κB信号通路中孰轻孰重仍需更多的探讨。

TF是动脉粥样硬化斑块形成血栓的关键因素，由于刺激因素的不同,所观察到的内皮细胞表达TF的细胞信号转导途径也有着差异，在众多刺激因素中普遍认为VEGF和TNF-α的作用最重要，而TNF-α被认为是巨噬细胞分泌的主要促炎细胞因子，可以通过 MAPK中所有的三条途径(p38MAPK、p44/42MAPK、JNK)以及经典的NF-κB途径的激活调节 TF的表达，参与粥样硬化斑块的形成、炎症反应、血管新生和肿瘤形成[26]。

2.3.3平滑肌细胞近些年的研究中,人们认识到动脉中膜血管平滑肌细胞(Vasuclar smooth muscle cells，VSMCs)增殖、游走进入内膜及基质蛋白的合成，是参与AS进展期病变形成的主要环节。VSMC的异常增殖与早期的血管增生性损伤有关，如动脉粥样硬化、高血压及PCI后的血管再狭窄等。LPS可上调VSMC表面TLR4的表达，是VSMC增殖的强效刺激物，LPS触发TLR4介导的信号通路在血管损伤后的血管重建和新生内膜形成过程中发挥着重要作用，促进心血管疾病的进展[27]。研究发现：游走的VSCM经其表面的LDL受体介导吞噬脂质，形成VSMC源性泡沫细胞，参与病变的形成,最近有研究发现在ApoE-/-小鼠模型中，oxLDL可以通过激活TLR4/MyD88/NF-κB炎症信号通路提高胆固醇酰基转移酶(A-cholesterol acyltransferase 1，ACAT1)的表达，刺激血管平滑肌细胞转化为泡沫细胞[28]。

oxLDL除了能显著促进人冠状动脉平滑肌细胞的增殖和迁移，并呈剂量依赖性，也可以使TLR4、炎症因子IL-1、 TNF-α、 MCP-1和MMP-2等表达水平上升，而在TLR4基因敲除的小鼠实验中未见TLR4的表达和其他炎症因子分泌明显增加[29]。ox-LDL诱导的p38和NF-κB的活化途径在TLR4-/-小鼠平滑肌细胞中能被抑制，表明TLR4在ox-LDL诱导平滑肌细胞炎症因子分泌以及p38和NF-κB途径的活化中起重要作用[28]。有研究人员认为衰老可能是导致动脉粥样硬化的原因之一，而上调的循环细胞因子水平是其显著特征。在无刺激条件下，取自年老的小鼠(16~18个月)和年幼的小鼠(2~4个月)的VSMC相比，有更高基础的IL-6分泌，趋化因子(如CCL2)、黏附分子(如ICAM)、先天性免疫受体(如TLR4)都有一定的表达增加，而在TLR4-/-和MyD88-/-小鼠中此现象则消失，证实TLR4和其接头子MyD88在随年龄增加VSMC的IL-6的基础分泌中发挥重要作用[30]。

3结语

β2GPI与抗β2GPI抗体复合物刺激血液单核细胞、血小板、血管内皮细胞活化，诱导促凝因子、炎症分子及黏附分子的高表达，是系统性自身免疫性疾病(如APS、SLE)血栓形成的重要因素。TLR4及其信号通路在介导β2GPI/抗β2GPI抗体复合物作用于细胞、参与APS等疾病病理机制中发挥重要作用。在动脉粥样硬化斑块形成过程中，除清道夫受体和Fcγ受体以外，TLR4是另一种重要的细胞表面受体，介导ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI复合物诱导巨噬细胞泡沫化，在AS的发生发展中同样发挥关键作用。然而，有关TLR4及其信号通路与β2GPI/抗β2GPI复合物在AS病理机制中的相互关系以及具体作用环节仍不清楚，期待更多的分子机制研究，加深对AS的认识，为其预防和治疗提供新的思路。

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[收稿2015-03-21修回2015-04-27]

(编辑张晓舟)

通讯作者及指导教师：周红(1957年-)，女，博士，教授，博士生导师，主要从事血栓与止血方面的研究，E-mail:hongzhou0123@163.com。

作者简介：王婷(1992年-)，女，在读硕士，主要从事临床检验诊断学方面的研究。

中图分类号R543.5

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)02-0262-05

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.027