人参皂苷Re对慢性缺血致血管性痴呆大鼠行为学及形态学的影响

2016-01-28孔祥怡郝利铭苏晓薇姜文华矫春宝徐忠信

中国老年学杂志 2015年21期

关键词：血管性痴呆

孔祥怡　郝利铭　苏晓薇　姜文华　矫春宝　任　翔　赵　晴　徐忠信

(吉林大学临床医学院,吉林　长春　130021)

人参皂苷Re对慢性缺血致血管性痴呆大鼠行为学及形态学的影响

孔祥怡郝利铭1苏晓薇1姜文华1矫春宝2任翔2赵晴3徐忠信3

(吉林大学临床医学院,吉林长春130021)

摘要〔〕目的探讨人参皂苷Re对慢性血管性痴呆(VD)大鼠的保护作用。方法应用分次离断结扎双侧颈总动脉造模法建立VD大鼠模型，利用Morris 水迷宫、HE染色和电镜技术观察人参皂苷Re的保护效果。结果分次离断结扎双侧颈总动脉后，大鼠认知能力下降，逃避潜伏期明显延长，神经细胞明显收缩，游离核糖体较多，细胞内线粒体出现空泡化。不同浓度人参皂苷Re可明显修复海马神经细胞的损伤。结论人参皂甙Re可显著改善大鼠认知能力，对脑血管缺血所造成的神经元损伤具有一定修复作用。

关键词〔〕人参皂苷；血管性痴呆；慢性缺血

1吉林大学白求恩医学部组织胚胎学系

2吉林大学白求恩医学部细胞生物学系

3吉林大学中日联谊医院神经内科

赵晴(1969-)，女，医学博士，教授，主任医师，主要从事脑血管疾病及痴呆研究。

第一作者：孔祥怡(1995-)，女，本科在读，主要从事脑血管疾病及痴呆研究。

我国血管性痴呆(VD)年发病率为5‰～9‰。西药治疗主要是应用胆碱酯酶抑制剂及促进脑代谢药物等，但可引发副作用，如神经精神异常及癫痫发作等〔1〕。人参皂苷(Ginsenoside)是一种固醇类化合物，主要存在于人参属药材中。它含有多种成分，其中人参皂苷Re为四环三萜类衍生物，具有抑制中枢神经、促进DNA和RNA合成、升高血浆皮质酮和扩张血管等作用〔2〕。人参皂苷 Re具有抑制心肌细胞凋亡、抗缺血性心律失常和保护心肌缺血再灌注损伤的作用〔3，4〕。本实验拟探讨人参皂苷Re对慢性缺血性VD大鼠的保护作用。

1材料和试剂

1.1实验动物、主要药品与试剂 Wistar 雄性大鼠，体重180～220 g，购自吉林大学基础医学院动物实验中心，质量合格证号：SCXK-(吉)2008-0005。饲养在24～26℃室温，正常光照、标准颗粒饲料喂养，自由进食和饮水。人参皂苷 Re(含量98%,20141118)由吉林大学化学中心天然药物化学研究室提供。水合氯醛购于天津化学试剂三厂。注射用青霉素钠(华北制药股份有限公司)购于吉林大学中日联谊医院。

1.2模型制备应用分次离断结扎双侧颈总动脉造模法建立VD大鼠模型。水迷宫筛选后第3天，给予造模组10%水合氯醛3～3.5 ml/kg体重，腹腔内注射麻醉后固定于手术台，将手术区消毒，并沿颈部正中切开皮肤，钝性分离右侧颈总动脉,用0号手术线结扎动脉的远心端与近心端,并从中间剪断，然后逐层缝合，术后1 w内每天肌肉注射青霉素预防感染。1 w后依同样方法结扎左侧颈总动脉。假手术组在同样条件下，只钝性分离双侧颈总动脉，其他操作同前。手术期间严密观察大鼠呼吸变化，确保有自主呼吸。术后死亡。

1.3分组与给药健康雄性Wistar鼠 80 只，造模后随机分为假手术组(S组)、模型组(M 组)、多奈派齐组、人参皂苷 Re 高剂量组 20 mg/kg、中剂量组 10 mg/kg和低剂量组 5 mg/kg。每组12只。每日灌胃给予相应药物，1次/ d ，连续给药30 d和90 d。S组和M组同期灌胃相应体积蒸馏水。

1.4Morris 水迷宫筛查〔5，6〕Morris 水迷宫的装置由一不锈钢圆形水池通过摄像机与电脑连接所组成。水池内壁被漆为黑色，直径160 cm，高50 cm，水深30 cm，水温保持在(26±2)℃。在目标象限(设为第三象限)内放有一个直径为12 cm，高29 cm的圆形黑色站台，位于水面下1 cm。实验在隔音、光线昏暗房间内进行，且环境在整个水迷宫实验阶段保持不变。训练时，将大鼠面向池壁，固定选取离平台最远象限作为入水点，记录大鼠在2 min内寻找到平台的轨迹和时间(逃避潜伏期)。如果超过2 min仍未找到平台，潜伏期计为120 s，结束后，试验者可以引导大鼠找到平台，并停留10 s。试验完后将大鼠放回鼠笼中。然后重新入水测试，直至全部2个入水点测试完毕。计算2次入水逃避潜伏期的平均值，作为该天该大鼠的成绩。训练连续5 d，每天训练1次，以搜索持续时间(逃避潜伏期)作为衡量大鼠记忆功能的标准，将得到的5组数据两两比较，以剔除个别不会游泳及在5次测试成绩均很差且无明显改善的大鼠。检测时，对造模后分别灌胃给药1个月和3个月的大鼠同样采用该方法测试学习记忆改善能力，记录寻找到平台的轨迹和时间。

1.5HE染色大鼠经10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速取出脑组织，经10%中性甲醛固定，常规石蜡切片，并苏木精-伊红染色(HE染色)，Olympus光学显微镜下观察海马组织结构并显微摄影。

1.6电镜样本的制备大鼠经10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速取出脑组织，取2 mm×2 mm×2 mm大小的右侧海马CA1区组织一块，置于2.5%戊二醛预固定,然后入1%锇酸继续固定,经70%、80%、95%乙醇、无水丙酮脱水，环氧树脂 Epon812 浸透和包埋,LKB-I 型超薄切片机切片,3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色,于日立 H-600透射电子显微镜观察海马组织的结构变化。

1.7统计学处理采用SPSS16.0统计学分析软件进行单因素方差分析。

2结果

2.1定位航行试验一般训练3 d后，大鼠逃避潜伏期基本趋于稳定，遂以 4～6 d的逃避潜伏期平均成绩为试验数据。与S组比较，M组潜伏期明显延长，提示双侧颈总动脉离断在一定程度上造成了大鼠空间学习记忆功能障碍。不同浓度Re组与M组比较,潜伏期均明显缩小，其中以低剂量Re组和高剂量Re组为最好(P<0.05)；中剂量Re组仅在给药1个月时表现出差异。表明，Re在一定时间和浓度下可提高VD大鼠的学习记忆能力。见表1。

表1　各组逃避潜伏期比较

与S组比较:1)P<0.01;与M组比较:2)P<0.05

2.2HE染色结果S组海马各区细胞排列均匀整齐，神经细胞轮廓清晰，细胞核大而圆、染色浅，核仁清晰。M组术后1个月，CA1、CA2、CA3和CA4区神经细胞发生收缩，细胞体积变小，部分神经胶质细胞染色加深；术后3个月，细胞体积有所增加。低剂量Re组术后1个月，神经细胞和神经胶质细胞体积均有轻微增加，细胞间隙变化不大；术后3个月，神经细胞体积继续增加，胶质细胞染色也开始变浅。中剂量Re组术后1个月和3个月，神经细胞和神经胶质细胞体积较低剂量Re组变化不明显。高剂量Re组术后1个月和3个月，神经细胞和神经胶质细胞体积比M组显著增大，细胞核染色浅，核仁清晰，同时神经胶质细胞染色变浅(图1)。

2.3超微结构结果S组细胞核圆形、染色浅，无异染色质，细胞内核糖体多，线粒体无空泡状，神经胶质细胞核中央为常染色质、异染色质位于核膜附近，核仁清晰，毛细血管周围的胶质细胞偶见水肿。神经元间存在突触，突触位于神经毡中。M组术后1个月，细胞核染色较浅，近核膜处偶见异染色质，细胞质内有大量核糖体，线粒体或局部空泡状，或整个线粒体呈空泡状，可见电子密度大的结构；海马内毛细血管周围神经胶质细胞处于严重水肿状态，同时，胶质细胞内有大量溶酶体。与术后1个月相比，术后3个月有所恢复，此时，神经元细胞质内线粒体空泡状线粒体减少，溶酶体减少，血管周围神经胶质细胞水肿减轻。神经元间存在突触，突触位于神经毡中，其结构同S组无显著差别。Re组术后1个月，神经细胞核染色浅，少量异染色质位于核膜或散在于细胞核中，线粒体较多、偶见空泡状；神经胶质细胞核染色浅、异染色质减少，核仁清晰，常染色质增加；毛细血管周围的线粒体仍然呈水肿状，但较M组减轻。术后3个月，神经细胞核染色浅，偶见异染色质，核仁清晰，线粒体多、偶见空泡化；毛细血管周围的神经胶质细胞有少量水肿，但较给药1个月时明显减轻神经元间存在突触，突触位于神经毡中，其结构同S组与M组无显著差别。见图2。

图1　各组海马结构染色结果(HE)

图2　各组海马细胞超微结构

3讨论

VD是脑血管疾病(多为脑血管供血不足)导致的记忆、认知功能障碍临床综合征，是老年人中最常见的痴呆类型之一〔7〕。由于老年人的血管普遍出现不同程度狭窄、使得脑细胞代谢和功能出现异常变化，部分患者出现VD。

Morris水迷宫实验是评价动物学习记忆能力的经典行为学实验。研究证实〔8，9〕，血管性认知功能障碍与慢性脑缺血引起的海马神经元损伤有关，当颈总动脉双侧结扎离断后，急性脑缺血可使海马区得不到正常血液供应，使海马神经元形态发生结构和功能的变化，从而形成记忆障碍。而改善缺血功能，促进血液循环，可修复海马神经元的损伤。据报道〔10〕，应用电针治疗VD小鼠时发现，电针刺激可使海马锥体神经细胞脱失减少，细胞核固缩；电子显微镜下，大鼠神经元细胞核完整，细胞质粗面内质网数量减少，游离核糖体多，部分线粒体嵴断裂、模糊或消失。本实验结果显示，VD大鼠神经细胞出现水肿。缺血后，神经细胞细胞代谢方式转变，神经胶质细胞损伤较重，线粒体能量供给减少，这与上述文献结果相似。人参皂苷 Re是从人参药材中提取出来的具有较高活性的天然成分。它具有抗缺血性心律失常和保护心肌缺血再灌注损伤的作用〔11〕。本研究结果提示，人参皂甙Re可对大鼠的认知能力有显著改善，对脑血管缺血所造成的神经元损伤具有一定修复作用。

参考文献4

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6吴章福，高晓平，李光武.改良双侧颈总动脉结扎法与传统法制备的大鼠慢性脑缺血模型比较〔J〕.中国康复医学杂志，2012;27(3):206-10.

7钟汝佳，陶定波，乐卫东.血管性痴呆病因及发病机制的研究进展〔J〕.转化医学杂志,2015;4(4):193-8.

8Rom GC.Vascular dementia: distinguishing characteristics,treatment,and prevention〔J〕.J Am Geriatr Soc,2003;51(5):S296-304.

9朱学芳,顾永健,陈芬.γ-氨基丁酸对慢性脑缺血致血管性痴呆大鼠学习记忆能力的影响〔J〕. 卒中与神经疾病,2010;17(4):232-5.

10赖新生,余瑾.电针治疗血管性痴呆的动物实验研究〔J〕.中国老年学杂志,2001;21(1):38-40.

11陈英杰,徐绥绪,裴玉萍,等.人参化学成分及其抗心律不齐构效关系的研究〔C〕.92 国际人参研讨会论文集，沈阳: 沈阳药学院,1992:169-70.

〔2014-11-17修回〕

(编辑张慧)

通讯作者：徐忠信(1965-)，男，医学博士，博士生导师，教授，主任医师，主要从事脑血管疾病研究。

基金项目：吉林省科技厅项目(No.20130727029YY);吉林省发改委项目(No.20150204057SF)

中图分类号〔〕R749.13〔