体外原代培养脑胶质瘤细胞对化疗药物敏感性的影响

张惊宇　张力娜　郑永慧　初婷婷　叶琳琳　赵　虹　杨子超

(哈尔滨医科大学附属第四医院神经内科,黑龙江　哈尔滨　150081)



体外原代培养脑胶质瘤细胞对化疗药物敏感性的影响

张惊宇张力娜郑永慧初婷婷叶琳琳赵虹杨子超

(哈尔滨医科大学附属第四医院神经内科,黑龙江哈尔滨150081)

摘要〔〕目的建立离体胶质瘤组织原代培养细胞，测试其对常用抗癌化疗药物的敏感性。方法手术切除54例人脑恶性胶质瘤，取3级星形细胞瘤在培养皿中进行原代培养，采用八肽胆囊收缩素(CCK-8)法检测恶性脑胶质瘤细胞对顺铂(DDP)、长春新碱(VCR)、替尼泊甙(VM-26)、替莫唑胺(TMZ)、尼莫司汀(ACNU)的体外敏感性。结果对原代培养肿瘤细胞进行药物敏感性试验，敏感率依次为VM-26>TMZ>ACNU>DDP>VCR(P<0.05)。结论用CCK-8法进行化疗药物的敏感性测定可以更好地辅助临床化疗和放疗，避免盲目使用药物。

关键词〔〕脑胶质瘤细胞；八肽胆囊收缩素

第一作者：张惊宇(1979-)，女，博士后，主要从事脑血管病的诊断及治疗的研究。

肿瘤干细胞(CSCs)对肿瘤细胞的存活、增殖凋亡和转移以及复发有着重要影响。肿瘤细胞的转移侵袭又依赖于其自身运动和迁徙能力。目前，人急性髓性白血病中已成功分离出肿CSCs〔1〕，而且发现CSCs对肿瘤的发生、发展、侵袭转移机制以及相应的治疗具有重要意义。脑胶质瘤是常见的原发性中枢神经系统的恶性肿瘤〔2～4〕。高级别的脑胶质瘤细胞具有强烈的侵袭性〔5〕，表现为急速的细胞分裂增生，并且伴随着新生血管生成。本研究通过进行脑胶质瘤细胞的原代培养，探究几种常见化疗药物在胶质瘤综合治疗方法中的效果。

1材料与方法

1.1主要材料及试剂标本均取自吉林大学第一医院手术切除的新鲜脑胶质瘤标本。5-氟尿嘧啶(上海生工)，胎牛血清(Thermo)，八肽胆囊收缩素(CCK-8)试剂盒(天津百莹公司)，含5%小牛血清的RPMI培养基(Gibco公司)，胰蛋白酶、注射用青霉素G钠、链霉素、二甲基亚砜(国药试剂)。5%CO2细胞培养箱(Thermo，美国)；DYF-880倒置荧光相差显微镜(Olympus，日本)；SM600自动酶标仪(UTRAO)；生物安全柜(BSC-1200A2，香港力康)；96孔细胞培养板(Amresco，美国)。

1.2化疗药物尼莫司汀(ACNU)、顺铂(DDP)、长春新碱(VCR)、替尼泊甙(VM-26)、替莫唑胺(TMZ)。其原液的血浆峰浓度(PPC)分别为0.99、0.53、3.50、5.99、3.67 μg/ml。5种药物均以此为基点，用生理盐水稀释成5种不同浓度，PPC按公式Log(PPC)=-0.788+(0.755×Log LD50)〔6〕。见表1。

1.3方法

1.3.1胶质瘤细胞的原代培养及纯化传代手术切下无菌肿瘤标本，迅速放入冰盒中并送到实验室细胞房中。打开生物安全柜，将新鲜的肿瘤标本用含青霉素和链霉素、不含血清的培养液进行反复冲洗，直至肿瘤细胞清洗干净并且没有杂质。接着将肿瘤细胞切成小块组织，移至离心管中混匀离心，加入2 ml提前37°C预热好的胰蛋白酶消化2 min，放在37℃培养箱中震荡1 h，离心机800 r/min，5 min后吸去上清液，在离心管中加入含10%胎牛血清的培养液，用吸管吸打、重悬、离心、反复重悬，用移液枪吸取200 μl重悬的肿瘤细胞悬液于96孔板中，混匀后放入细胞培养箱中进行培养，48 h后换液，倒掉原有的培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍，再加入不含血清的培养液进行培养，反复进行换液培养孵育，最后置入5%CO2、37℃恒温、保湿细胞培养箱培养待用。

1.3.2CCK-8法检测取100 μl肿瘤细胞悬液于96孔板中，并放在细胞培养箱中培养24 h(37℃、5%CO2)。每孔中加入10 μl不同浓度的各种抗肿瘤药物并均设3个重复，同时设置对照组，在恒温细胞培养箱中孵育24、48、72 h，将CCK-8溶液进行预热，然后向每个孔中加入CCK-8溶液10 μl，继续培养1～4 h后用酶标仪(选择450 nm波长)检测OD值，取3孔OD值的平均数，根据下列公式计算细胞生长抑制率(IR)=(1-实验组OD值/无药组OD值)× 100%，IR在50%以上认为对该药敏感, IR<50%归入耐药。

1.4统计学方法应用SPSS17.0软件行χ2或校正χ2检验。

2结果

2.1脑胶质瘤原代细胞培养结果54例脑胶质瘤标本，32例培养成功，药敏实验价率为89.3%。24 h时肿瘤细胞生长良好，形态正常，以后梭形细胞逐渐增多；48 h后肿瘤细胞形态发生变化，梭形较多；72 h后可见星形细胞明显突起，呈不规则及放射状，细胞体积增大。见图1。

图1　倒置显微镜下观察原代培养胶质瘤细胞形态

2.2各种化疗药物对脑胶质瘤细胞的IR对54例恶性脑胶质瘤标本进行原代细胞培养，22例培养失败。培养成功的32例标本中胶质瘤Ⅲ级20例，Ⅳ级12例(男6例，女6例)。以抗肿瘤药物在血浆峰浓度(PPC)观察培养成功的32例标本的抑制情况，敏感率从大到小依次为：VM-26(12例，37.5%)>TMZ(11例，34.4%)>ACNU(8例，25.0%)>DDP(7例，21.9%)>VCR(6例，18.8%)(χ2=32.4，P<0.05)。耐药

率ACNU15例(46.9%)，TMZ18例(56.3%)，DDP10例(31.3%)，VM-26 9例(28.1%)，VCR17例(53.1%)。

3讨论

目前，脑胶质瘤尤其是恶性脑胶质瘤仍然是无法完全治愈的疾病。有研究显示，脑胶质瘤最佳手术时间≤15个月，并且仅26.5%的病人经过诊断后能够生存2年〔6〕。治疗以手术切除为主，并辅以各种化疗药物抑制肿瘤细胞的生长，以此减轻病人的痛苦。所以，研究化疗药物对肿瘤细胞的敏感性变得尤为重要。由于涉及伦理方面的考虑，不能直接以患者个体为临床实验对象，只能够利用最接近个体肿瘤细胞形状的原代培养方法，对肿瘤细胞进行培养，模拟出与人脑中生长的脑胶质瘤细胞相近的细胞进行药敏研究。

原代培养过程中最需要注意的就是污染问题，需严格注意培养时的无菌操作，任何步骤都应在生物安全柜中进行；在对组织进行处理时，需要剔除掉那些坏死的组织，保持组织的相对纯净，并且取得的组织最好是未经放疗和化疗的，否则会影响细胞原代培养的成功。人脑胶质瘤标本中除胶质瘤细胞外,尚含一定量的脑胶质细胞、成纤维细胞、血细胞、脑膜内皮细胞等杂质细胞〔7〕。将组织切成很小的组织块，这样更有利于培养。本文中培养细胞时未采用单细胞培养的方法，导致细胞之间相互作用，故导致一些细胞原代培养失败。

本文采用的5种化疗药物都是如今已用于临床上的药物，但由于每个病人的个体性质不同，所以对不同病人施用不同种类和浓度的药物都会产生差异性。本研究结果表明恶性脑胶质瘤对VM-26、TMZ相对敏感，同时也发现存在对VM-26、TMZ不敏感的个体。故在恶性脑胶质瘤化疗前做体外药敏试验，选择对不同个体敏感的化疗药物进行个体化化疗非常必要。

参考文献4

1AI-Hajj M,Becker MW,Wicha M,etal.Therapeutic implications of cancer stem cells〔J〕.Curr Opin Genet Dev,2004；14(1)：43-7.

2Nikiforova MN, Hamilton RL.Molecular diagnostics of gliomas〔J〕.Arch Pathol Lab Med, 2011；135(5)：558-68.

3Kim JH, Zheng LT, Lee WH,etal.Pro-apoptotic role of interin β3 in glioma cells〔J〕.J Neurochem, 2011；117(3)：494-503.

4Savaskan NE, Seufert S, Hauke J,etal.Dissection of mitogenic and neurodegenerative actions of cysteine and glutamate in malignant gliomas〔J〕.Oncogene, 2011；30(1)：43-53.

5方川, 檀艳丽, 王佳良, 等.人脑胶质瘤原代细胞培养及体外药物敏感度的实验〔J〕.肿瘤防治研究, 2010；37(12)：1380-2.

6易伟,牛洪泉, 陶胜忠.人脑胶质瘤细胞的原代培养及生长活性观察〔J〕.中华神经外科疾病研究杂志,2005；4(3)：245-7.

7李剑.脑胶质瘤MGMT、MRP、P-gp表达与化疗药物敏感试验的相关研究〔D〕.洛阳：河南科技大学硕士论文, 2011：8-31.

〔2015-03-17修回〕

(编辑袁左鸣)

通讯作者：杨子超(1950-)，男，主任医师，硕士生导师，主要从事脑梗死的溶栓治疗及溶栓后神经功能维护的研究。

基金项目：黑龙江省自然科学基金面上项目(No.p01423)；黑龙江省教育厅科学技术项目(No.12531257)；哈尔滨市科技局青年后备人才项目(No.2013RFQYJ062)

中图分类号〔〕R73〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)21-6023-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.009