通心络联合阿托伐他汀、阿司匹林对家兔动脉粥样硬化早期血管外膜炎症因子表达的影响
2016-01-28郎艳松秘红英刘美之袁国强
郎艳松 秘红英 刘美之 袁国强
(河北医科大学，河北 石家庄 050017)
通心络联合阿托伐他汀、阿司匹林对家兔动脉粥样硬化早期血管外膜炎症因子表达的影响
郎艳松1秘红英1刘美之1袁国强2，3
(河北医科大学，河北石家庄050017)
摘要〔〕目的探讨“金三角”(ATS)方案即通心络联合阿托伐他汀、阿司匹林对家兔动脉粥样硬化早期颈动脉外膜炎症因子表达的影响。方法高脂饮食复合单侧颈总动脉硅胶管包裹制备兔动脉粥样硬化早期模型。72只新西兰兔随机分为对照组、模型组、通心络(TXL)组、阿托伐他汀(ATO)组、阿司匹林(ASP)组和ATS组，每组12只。对照组给予普通饲料、模型组及各用药组家兔均实施单侧颈动脉硅胶管包裹术复合高脂饲料喂养，TXL组给予通心络超微粉混悬液0.3 g·kg-1·d-1灌胃，ATO组给予阿托伐他汀2.5 mg·kg-1·d-1灌胃，ASP组给予阿司匹林12 mg·kg-1·d-1灌胃，ATS组给予TxL、ATO、ASP三者联合，剂量上，灌胃，连续给药，4 w后取材，HE染色判定颈动脉内中膜病理形态变化，生化法检测血脂变化，ELISA法测定各组家兔颈动脉包裹段外膜单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、白介素(IL)-1β、IL-10表达水平，免疫组化法检测血管外膜IL-8表达水平。结果与对照组比较，模型组总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)表达明显增强(P<0.01)。与模型组比较，除ASP组外，各用药组TC、TG、LDL-C表达明显减弱(P<0.01)。与其他用药组比较，ATS组TC、TG、LDL-C表达明显减弱(P<0.01)。与对照组比较，模型组颈动脉外膜中MCP-1、IL-1β表达明显增强，IL-10表达减弱(均P<0.01)。与模型组比较，各用药组颈动脉外膜中MCP-1、IL-1β表达减弱(P<0.01)，IL-10表达增强(P<0.05)。与其他用药组比较，ATS组MCP-1、IL-1β表达明显减弱，IL-10表达明显增强(均P<0.01)。各用药组颈动脉外膜IL-8表达减少。结论TXL、ATO、ASP三药联用可通过降脂、调节血管外膜炎症反应从而有效延缓动脉粥样硬化进程，且较单药应用作用更佳。
关键词〔〕外膜；炎症；动脉粥样硬化；MCP-1；IL-8；IL-10
1河北以岭医药研究院国家中医药管理局重点研究室(心脑血管络病)
2河北医科大学附属以岭医院心血管科(国家中医药管理局中医络病学重点学科)
3河北省络病重点实验室
第一作者：郎艳松(1988-)，女，硕士，医师，主要从事心血管病学研究。
随着对动脉粥样硬化(AS)发病模式研究的不断深入，“由内而外”的炎症发病机制逐渐向“由外而内”转变。外膜炎症浸润程度与AS严重程度呈正相关，外膜炎症细胞分泌多种细胞因子，影响内膜的变化，还可以通过神经末梢及直接作用于平滑肌受体影响中膜，促进AS的发生、发展〔1〕。在AS早期血管外膜即有MCP-1等的表达，并最终引起炎性细胞聚集在血管壁，进而导致内膜增厚。基于polypill策略〔2〕，即在固定药物剂量的基础上联合用药，减少危险因素的同时未导致不良反应的风险提高，从而控制心血管病危险因素，减少心脑血管的发病风险。吴以岭院士提出他汀类药物联合应用阿司匹林及中药通心络胶囊，形成有效防治缺血性心脑血管疾病的“金三角”(ATS)优选方案。本实验拟研究该方案对动脉粥样硬化早期血管外膜炎症因子表达的影响。
1材料和方法
1.1动物与分组72只雌雄各半的健康新西兰白兔，体重(1.8±0.2)kg，购自北京富豪实验动物养殖中心。单笼饲养在河北省络病重点实验室。适应性喂养1 w后随机分为对照组、模型组、通心络(TXL)组、阿托伐他汀(ATO)组、阿司匹林(ASP)组和ATS组，每组12只。对照组给予普通饲料，其余各组硅胶管包裹后给予高脂饲料(胆固 醇1%，蛋黄粉7.5%，猪油5%，基础饲料86.5%，由河北医科大学实验动物中心加工定制)〔3〕。同时根据人与动物用药量体表面积计算法，临灌胃时用0.5%羧甲基纤维素钠水溶液将通心络超微粉、阿托伐他汀和阿司匹林配成相应浓度(所用浓度为临床等效量)的混悬液，浓度依次为：0.3 g·kg-1·d-1、2.5 mg·kg-1·d-1和12 mg·kg-1·d-1，ATS组灌胃ATO TXL超微粉混悬液加ATO加ASP灌胃，剂量。每日定量给予150 g普通饲料或高脂饲料喂)同时灌胃给药，自由饮水，连续喂养4 w。
1.2药品与试剂ASP超微粉(石家庄以岭药业股份有限公司，批号：20120924)、ATO片(辉瑞制药有限公司生产，批号：1237179)、ASP(石药集团欧意药业有限公司批号：018130311)；羧甲基纤维素钠(天津永大化学试剂开发中心，批号：20130418)；总胆固醇(TC)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒(北京九强生物有限公司)、单核细胞趋化因子(MCP)-1、白细胞介素(IL)-10 ELISA试剂盒(美国Cloud-Clone公司 批号：L131226551、L131226557)和考马斯亮蓝染色试剂盒( 南京建成生物工程研究所，批号：20131212)；
1.3主要仪器Sigma-3k15型高速冷冻离心机(Sigma)、日立7080型全自动生化分析仪(Hitachi)、XDTll酶标分析仪(上海迅达医疗仪器公司)、MDF-U50V型-80℃冰箱(日本SANYO公司)和IF300-150型制冰机(韩国iLshin公司)。
1.4方法
1.4.1硅胶管包裹术自耳缘静脉注射3%戊巴比妥(1 ml/kg)，将新西兰白兔仰卧位固定于手术台上，脱毛后常规消毒，铺洞巾。沿其颈部正中线剪开皮肤并逐层钝性分离，右侧颈动脉鞘暴露后，仔细游离出右颈动脉(RCA)约2.5 cm。用准备好的硅胶管纵向切开后包裹于RCA外，滴加青霉素预防感染。术后，缝合伤口，自主苏醒。术后2次/d、连续3 d局部消毒，预防感染。
1.4.2样品采集喂养4 w后，采集前12 h禁食禁水，3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉(1 ml/kg)，腹主动脉取血。严格无菌操作，剃毛后消毒，沿颈部正中线剪开，快速分离并取下包管侧颈动脉，并一分为二，生理盐水洗净，一部分10%中性甲醛溶液保存，另一部分液氮冻存备用。剩余组织制作石蜡切片做苏木精-伊红(HE)染色。
1.4.3病理标本光镜观察取固定标本，脱水、石蜡包埋，切片约4 μm，HE染色，光镜观察。
1.4.4血脂测定取全血后，4℃，3 500 r/min离心10 min，取上清液分装入EP管，采用全自动生化分析仪测定TC、TG、LDL-C水平。
1.4.5炎症指标测定检测指标前取出液氮冻存标本，各组动物组织取相同大小，置于预冷的PBS液中，去除管周组织，纵向剖开血管，仔细剥离外膜，吸干称重。放置于试管中加入生理盐水，比例为1∶9，制成10%的组织匀浆。3 000 r/min，离心15 min，取上清液待测。严格按照酶联免疫吸附试剂盒进行操作，酶标仪测吸光度(A)值，根据标准曲线推算组织匀浆中的浓度。考马斯亮蓝法进行蛋白定量，计算每克蛋白中MCP-1、IL-1β、IL-10的含量。免疫组化法检测血管外膜IL-8表达。
1.5统计学处理 应用SPSS19.0统计软件，采用单因素方差及LSD法检验，如方差不齐者用DunnettsT3检验。
2结果
2.1各组兔颈动脉光镜观察对照组：内皮细胞完整，胞核扁平，与内弹力板贴合紧密，中层平滑肌细胞排列整齐；模型组：内皮细胞有脱落，内膜层明显增厚,可见少量泡沫状巨噬细胞形成；各用药组内膜层部分增厚，但动脉损伤程度减轻，以阿托伐他汀组、通心络组及ATS组改善更为明显，见图1。
2.2血脂与对照组比较，模型组血清TC、TG、LDL-C水平显著增高(P<0.01)；除ASP组外，各用药组均有一定降脂作用，与模型组比较有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，但ATS组与其他用药组比较降脂作用更为突出(P<0.01)；其余各用药组之间两两比较无统计学意义(P>0.05)，见表1。
2.3外膜炎症指标变化与正常组比较，模型组MCP-1、IL-1β表达明显增多，IL-10表达减少(P<0.01)；与模型组比较，各用药组MCP-1、IL-1β表达均减少，IL-10表达增加(P<0.01，P<0.05)；ATS组与其他用药组分别比较均有统计学意义(P<0.01)；其余各用药组之间两两比较无统计学意义(P>0.05)，见表2。与空白组比较，模型组IL-8在血管外膜新生滋养血管处表达增多，与模型组比较，各用药组外膜新生滋养血管数量减少(IL-8在微血管内皮细胞阳性表达呈现棕褐色，凡是呈现棕色的并与临近组织有明显界限，可视为一个微血管〔4〕)同时IL-8表达减少，见图2。
图1 各组颈动脉组织HE染色情况(×400)
图2 各组颈动脉外膜IL-8表达情况(免疫组化，×400)
组别TCTGLDL-C对照组3.082±0.8460.882±0.2362.59±0.64模型组52.55±11.2821)6.546±1.2931)11.23±0.461)TXL组37.8±6.6973)4)3.65±0.62582)4)5.97±0.442)4)ATO组31.5±7.1922)4)3.392±0.7822)4)5.12±0.372)4)ASP组49.43±3.7975.286±1.610.93±0.52ATS组23.7±0.8282)2.035±0.2932)4.1±0.242)
与对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01，3)P<0.05；与ATS组比较：4)P<0.01；下表同
表2 各组颈动脉外膜MCP-1、IL-1β、IL-10
3讨论
新西兰白兔是制备动脉粥样硬化模型的常用动物之一〔5〕，本研究联合“颈动脉硅胶管包裹+高脂喂养”在较短时间内制备AS早期模型〔6〕，结果显示4 w模型组AS程度与人类AS早期征象-血管壁内膜层增厚，脂纹形成的病理改变相似〔7〕。
动脉外膜炎症是诱发AS发生的早期事件之一〔8〕。已有研究表明血管外膜炎症的出现先于AS病理形态学改变〔9〕，在AS形成时，腹主动脉外膜有大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润〔10〕，外膜浸润的炎性细胞除B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核-巨噬细胞外还有肥大细胞〔11〕，浸润程度与AS严重程度相对应，这些炎性细胞又可分泌IL-1、IL-8、MCP-1等细胞因子〔12〕。
在AS早期，MCP-1基因即表达，此外受到TNF-α、IL-1、干扰素等的刺激诱导时，MCP-1基因均会明显增加〔13〕，随后出现分泌大量MCP-1的巨噬细胞〔14〕，而MCP-1与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。高脂等干预引起血流机械力的改变诱导血管内皮细胞和平滑肌细胞生成MCP-1〔15〕，吸引滋养血管内的单核细胞经血管壁游出并聚集到动脉外膜进而成为巨噬细胞后又释放大量的MCP-1，引起单核细胞迁移进入内膜下，大量炎症细胞在血管内膜聚集，进而导致动脉内膜层增厚，促进动脉粥样硬化的发生发展〔16〕。他汀类药物、阿司匹林、通心络均能通过不同机制发挥其抗炎作用〔17～19〕，本结果证实各用药组能够明显减少血管外膜MCP-1表达，ATS组作用更为突出。
MCP-1还能够诱导单核细胞自身合成,过程由IL-10调节〔20〕，IL-10作为参与AS的单一的抑炎因子，可抑制多种炎症因子的表达，同时能抑制单核细胞对内皮细胞的黏附，在AS进程中起保护作用。本结果提示各用药组均能通过增加IL-10的表达发挥保护作用，ATS组效果优于三药单用。
炎症反应发生时IL-8基因在血管内皮细胞大量表达，因此在血管外膜可见在滋养血管周围IL-8呈现黄褐色表达，IL-8和MCP-1作用相似，能促使单核细胞在内皮细胞上的滚动转变成强有力的黏附，同时IL-8也能够促进内皮细胞和平滑肌细胞的增殖和迁移，在AS中发挥着重要作用〔21〕。外膜上的IL-1β能够诱导炎症细胞在外膜的聚集，进而导致内皮细胞和平滑肌细胞增殖。实验中各用药组能够减少IL-8和IL-1β减少内皮细胞增殖和迁移，其中三药联用组优于三药单用组。以往的临床和基础实验已证实ATS方案在降脂、稳定斑块方面作用明显〔22〕，效果优于三药单用〔22〕。
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〔2014-12-09修回〕
(编辑李相军)
Effects of Tongxinluo combined with atorvastatin and aspirin on the adventitia inflammation in the early stage of atherosclerosis
LANG Yan-Song,MI Hong-Ying，LIU Mei-Zhi,etal.
Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,Hebei,China
【Abstract】ObjectiveTo discuss the effect of Tongxinluo combined with atorvastatin(ATO) and aspirin(ASP) on the adventitia inflammation of early atherosclerosis lesions in rabbits.MethodsSeventy-two New Zealand rabbits were randomly divided into control，model，tongxinluo(TXL)，ATO，ASP,golden triangle(Tongxinluo combined with ATO and ASP,ATS) groups(n=12).All the groups were fed with medicine for 4 weeks.The tissue slice of carotid artery was stained by HE and observed under light microscope.The changes of blood liquid were detected by biochemical assay.ELISA was used to measure the carotid artery adventitia of MCP-1,IL-1β,IL-10.The immunohistochemical staining was used to detect the protein expression of IL-8 around the carotid artery adventitia .ResultsCompared with those of normal group，the contents of TC,TG,LDL-C were significantly increased(P<0.01)，the content of IL-10 was significantly decreased(P
【Key words】Adventitia;Inflammation；Atherosclerosis;MCP-1;IL-8;IL-10
通讯作者：袁国强(1977-)，男，主任医师，硕士生导师，主要从事心血管病学研究。
基金项目：国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(No.2012CB518606)
中图分类号〔〕R543〔
文献标识码〕A〔
文章编号〕1005-9202(2015)21-6008-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.003
