硫化氢对糖尿病大鼠心肌纤维化及CX40和CX45表达的影响

肖　婷　罗　健　吴志雄　周松柏　李　芳　杨　军

(南华大学附属第一医院心血管内科，湖南　衡阳　421001)



硫化氢对糖尿病大鼠心肌纤维化及CX40和CX45表达的影响

肖婷罗健吴志雄周松柏李芳杨军

(南华大学附属第一医院心血管内科，湖南衡阳421001)

摘要〔〕目的探讨气体信号分子硫化氢(H2S)对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠心肌纤维化及缝隙连接蛋白C×40和C×45的影响。方法SD大鼠随机分为对照组、糖尿病大鼠组(STZ组)、硫化氢干预糖尿病大鼠组(STZ+H2S组)及硫化氢干预正常大鼠组(H2S组)。腹腔注射STZ(40 mg/kg)建立糖尿病模型；糖尿病模型建立后，STZ组与H2S组每天腹腔注射浓度为100 μmol/kg硫氢化钠溶液(H2S供体)；8 w后处死大鼠。碱水解法检测羟脯氨酸表达水平；Western印迹检测CX40和CX45蛋白的表达。结果与对照组相比，STZ组大鼠心肌组织羟脯氨酸表达明显增加(P<0.01)，CX40表达明显下降(P<0.001)，而CX45表达明显增多(P<0.01)。与STZ组相比，硫化氢干预后的STZ+H2S组大鼠心肌组织羟脯氨酸明显下降(P<0.01)，CX40表达明显升高(P<0.01)，CX45表达有下调趋势，但结果未显示出统计学意义。结论H2S可改善糖尿病大鼠心肌纤维化，同时上调CX40蛋白的表达，可能参与糖尿病大鼠的心肌纤维化和缝隙连接重构的调控。

关键词〔〕硫化氢；糖尿病；纤维化； CX40；CX45

第一作者：肖婷(1988-)，女，硕士，主要从事糖尿病心肌病发病机制研究。

糖尿病心脏病变包括心肌结构重构以及其伴随的电生理重构，一方面心肌结构重构最终可导致心力衰竭；另一方面，糖尿病引起的电生理重构可明显增加恶性心律失常和急性心脏事件的发生率〔1〕。而改善糖尿病心肌结构重构及电生理重构对于防治糖尿病心肌病和降低糖尿病患者急性心脏事件的发生率至关重要。缝隙连接是心肌细胞之间的半通道以及直接通讯，其生理作用主要是为心肌细胞间提供电化学交流，它与细胞的代谢和分化，物质的运输和电兴奋的传导等有密切关系。缝隙连接重构可导致心肌细胞间电传导异常，从而诱发心律失常。有研究发现硫化氢(H2S)可以改善糖尿病大鼠心脏重构〔2〕；此外，H2S还可以减少缺血再灌注心律失常的发生〔3〕，而H2S对糖尿病心肌缝隙连接重构的影响目前尚少见报道。本研究拟观察糖尿病大鼠心肌纤维化及心室肌缝隙连接蛋白CX40和CX45表达的变化，同时探讨H2S对糖尿病大鼠心肌纤维化和CX40和CX45蛋白表达的影响。

1材料与方法

1.1实验动物成年的雄性SD大鼠，体重(300±20)g，购自长沙动物实验中心；动物饲养在恒温(23±1℃)、恒湿(60%)的环境中，白天黑夜各12 h；实验动物可以自由获得食物和水。

1.2主要实验试剂链脲佐菌素(STZ)购自美国MP Biomedicals Company;硫氢化钠购于美国Sigma公司；羟脯氨酸碱水解法检测试剂盒，购于南京建成工程研究所；BCA蛋白定量试剂盒、购于中国博士德公司细胞裂解液，购于碧云天公司；抗兔二抗购于美国Proteintech公司。

1.3实验分组及糖尿病模型建立饲养大鼠1 w；随机分为，对照组、糖尿病大鼠组(STZ组)、硫化氢干预糖尿病大鼠组(STZ+H2S组)及硫化氢干预正常大鼠组(H2S组)，每组7只。STZ组与STZ+H2S组大鼠根据体重腹腔注射STZ(40 mg/kg)；注射后的24 h，为防止大鼠发生低血糖休克，给予5%葡萄糖水；注射后72 h，尾静脉采血测血糖，血糖>16.7 mmol/L提示造模成功。造模成功后，对照组和STZ组每天腹腔注射等量生理盐水；STZ+H2S组与H2S组每天腹腔注射硫氢化钠溶液(100 μmol/kg)；实验持续8 w。

1.4碱水解法检测羟脯氨酸表达水平取新鲜大鼠左心室心肌组织，提取组织蛋白，根据检测试剂盒说明书处理样本，加入96孔板，孵育30 min后置于450 nm波长检测吸光度(OD值)，根据OD值计算羟脯氨酸表达量。

1.5Western印迹检测CX40及CX45蛋白的表达取新鲜大鼠左心室心肌组织；研磨、离心后提取蛋白；采用BCA比色法进行蛋白定量，各组用PBS稀释至相同浓度；蛋白样品在100℃煮沸5 min；配置10%SDS-PAGE 分离胶、5%浓缩胶；按每孔20 μl细胞蛋白样品上样，置于电泳缓冲液中电泳，分离目的蛋白，将目的条带切下，半干转法转膜(10 V，30 min)，将蛋白质转移至PVDF膜。用TBST配制的5%BSA封闭2 h，封闭后分别孵育CX40及CX45一抗(稀释度为1∶500)，4℃过夜；用TBST洗膜3次；每次10 min；用HRP标记的二抗(稀释度为1∶2 000)37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL显色，曝光后扫描，用Image J图像分析软件进行光密度分析。GAPDH为内参。

1.6统计学分析采用SPSS18.0软件行单因素方差分析。

2结果

2.1H2S对糖尿病大鼠心室肌羟脯氨酸表达的影响与对照组〔(0.327±0.023)μg/mg〕相比，STZ组大鼠左心室心肌组织中羟脯氨酸表达〔(0.521±0.070)μg/mg〕明显增加(P<0.01)，而与STZ组相比，STZ+H2S组大鼠心肌组织中的羟脯氨酸水平〔(0.370±0.084)μg/mg〕明显下降(P<0.01)，H2S组为〔(0.331±0.052)μg/mg〕。

2.2H2S对糖尿病大鼠心脏CX40蛋白表达的影响与对照组(1.000±0.000)相比，STZ组大鼠心肌组织中CX40的表达(0.646±0.050)明显下降(P<0.001)，而与STZ组相比，STZ+H2S组大鼠心肌组织中CX40表达(0.846±0.088)明显上调(P<0.01)。H2S组为1.022±0.029。见图1。

2.3H2S对糖尿病大鼠心肌CX45蛋白表达的影响与对照组(1.000±0.000)相比，STZ组中的大鼠心肌中的CX45表达(1.219±0.015)明显增加(P<0.01)，而与STZ组相比，STZ+H2S组大鼠心肌组织CX45表达(1.195±0.033)有下调趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，H2S组为0.906±0.025，见图2。

图1　H2S对糖尿病大鼠心肌组织CX40表达的影响

图2　H2S对糖尿病大鼠心肌组织CX45表达的影响

3讨论

糖尿病心脏损害是糖尿病主要的并发症之一，糖尿病心肌病的主要表现就是心肌的结构重构和电生理重构，最终可导致心力衰竭和心律失常〔4〕。心肌纤维化是糖尿病心肌重构的主要表现，而胶原蛋白是构成结缔组织中胶原纤维的主要成分，其中羟脯氨酸的含量最多，故通常以羟脯氨酸可以作为心肌纤维化检测指标之一。本研究提示糖尿病大鼠心肌发生纤维化；与此同时，糖尿病大鼠心脏CX40表达明显下降。CX40是电导最快的缝隙连接蛋白，主要分布在心室浦肯野传导系统〔5〕。已知的缝隙连接蛋白中有5种位于心脏中，包括CX31.9、CX37、CX40、CX43和CX45，在人类心肌主要有CX40、CX43和CX45，其中CX43是心室肌细胞中主要的缝隙连接蛋白，其对维持心脏电活动的正常进行有着重要作用〔6〕，而CX40和CX45在心室肌中相对较少，研究也相对较少，但目前认为，CX40和CX45在心脏电生理重构中也起着重要作用〔7〕。CX45是电导速度慢于CX40的缝隙连接蛋白，其在心室表达水平略低于心房，主要分布在传导组织。本文结果与Yamada等〔8〕在心力衰竭病人左心室肌中观察到的结果类似，在其他缝隙连接蛋白，如CX40和CX43表达下调得同时，CX45表达却明显增高，可能是由于CX40和CX43表达下降后，心肌在电生理重构过程中代偿性的出现CX45上调。

H2S是一种具有广泛生理功能的气体信号分子。大量研究证明了H2S的抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，在心血管系统和神经系统中扮演着保护剂的角色〔3，9，10〕。本研究发现，气体信号分子H2S可明显逆转糖尿病所致大鼠心脏CX40和CX43表达下降(CX43的相关结果将于另文发表)，同时有抑制糖尿病大鼠心肌中CX45表达上调的趋势，H2S对正常大鼠心脏组织CX40和CX45的表达均无影响。本研究结果提示，H2S可通过上调CX40和CX43表达改善糖尿病大鼠心肌的电生理重构，并有抑制糖尿病大鼠心肌中CX45上调的趋势。而H2S干预改善糖尿病大鼠心肌缝隙连接重构的机制可能与其改善心肌纤维化和心肌结构重构有关。本研究结果提示H2S可通过减轻糖尿病大鼠心肌纤维化从而改善糖尿病大鼠心肌结构重构和电生理重构。但H2S改善缝隙连接重构在糖尿病心肌病防治中临床应用以及其保护作用的信号转导调控机制仍有待进一步研究。

参考文献4

1Gallego M，Alday A，Urrutia J，etal.Transient outward potassium channel regulation in healthy and diabetic hearts〔J〕.Can J Physiol Pharmacol，2009;87(2):77-83.

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3陈协辉，李鹏，黄小平，等.气体信号分子硫化氢对大鼠心肌缺血再灌注心律失常的影响〔J〕.心血管康复医学杂志，2010;19(5):478-81.

4Galderisi M.Diastolic dysfunction and diabetic cardiomyopathy: evaluation by Doppler echocardiography〔J〕.J Am Coll Cardiol，2006;48(8):1548-51.

5Lo CW.Role of gap junctions in cardiac conduction and development: insights from the connexin knockout mice〔J〕.Circ Res，2000;87(5):346-8.

6庞勇，刘新伟，何东伟，等.缝隙连接蛋白43在七氟醚后处理保护大鼠离体心肌缺血再灌注中的作用〔J〕.第三军医大学学报，2012;34(14):1422-5.

7Sohl G，Willecke K.Gap junctions and the connexin protein family〔J〕.Cardiovasc Res，2004；62(2):228-32.

8Yamada KA，Rogers JG，Sundset R，etal.Up-regulation of connexin45 in heart failure〔J〕.Cardiovasc Electrophysiol，2003;11(14):1205-11.

9Kida K，Yamada M，Tokuda K，etal.Inhaled hydrogen sulfide prevents neurodegeneration and movement disorder in a mouse model of Parkinson′s disease〔J〕.Antioxidantredox Signal，2011;15(2):343-52.

10Wang Y，Zhao X，Jin H，etal.Role of hydrogen sulfide in the development of atherosclerotic lesions in apolipoprotein E knockout mice〔J〕.Arteriosclethromb Vasc Biol，2009;29(1):173-9.

〔2015-02-11修回〕

(编辑李相军)

The effect of hydrogen sulfide on myocardial fibrosis and expressions of CX40 and CX45 in diabetic rats

XIAO Ting, LUO Jian, WU Zhi-Xiong,etal.

Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of South China University，Hengyang 421001，Hunan，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of hydrogen sulfide(H2S) on myocardial fibrosis, CX40 and CX45 expressions of diabetic rats induced by STZ.MethodsSD rats were randomly divided into control, STZ, diabetic mellitus treated with H2S(STZ+H2S), normal rats treated with H2S(H2S)groups. Diabetic model was induced by intraperitoneal injections of STZ with 40 mg/kg body weight. NaHS (H2S donor) was intraperitoneal injected to STZ and H2S group with 100 μmol/kg body weight every day. Rats were killed 8 weeks later. The hydroxyproline expression was tested by Alkail hydrolysis. The CX40 and CX45 expressions were analyzed by Western blot.ResultsThe expression of hydroxyproline was obviously increased in diabetic rats heart, H2S decreased hydroxyproline expression of diabetic rats heart (P<0.01). CX40 expression was obviously decreased in diabetic rats heart, H2S increased CX40 expression of diabetic rats (P<0.01). The expression of CX45 was increased obviously in diabetic rats (P<0.01), H2S decreased expression trend of CX45, however, the difference showed no statistical significance.ConclusionsH2S could improve myocardial fibrosis of diabetic rats and increase expression of CX40. H2S might be related to the regulation of myocardial fibrosis and remodeling of gap junction in diabetic rats.

【Key words】Hydrogen sulfide; Diabetic; Fibrosis; CX40; CX45

通讯作者：杨军(1972-)，男，医学博士，主任医师，副教授，硕士生导师，主要从事糖尿病心肌病研究。

基金项目：国家自然科学资助项目(No.81202830)

中图分类号〔〕R587〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)21-6025-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.010