茯苓山药片中非法添加格列本脲的快速筛查

2016-01-27颖裴明日栾国华

中国药物经济学 2015年10期

关键词：薄层色谱

聂颖裴明日栾国华

1吉林市疾病预防控制中心，吉林吉林 132001

2吉林市食品药品检验所，吉林吉林 132001

3吉林市食品药品检验所，吉林吉林 132001

茯苓山药片中非法添加格列本脲的快速筛查

聂颖1裴明日2栾国华3

1吉林市疾病预防控制中心，吉林吉林 132001

2吉林市食品药品检验所，吉林吉林 132001

3吉林市食品药品检验所，吉林吉林 132001

【摘要】目的建立薄层色谱法对茯苓山药片中非法添加化学药品格列本脲进行快速筛查。方法以格列本脲对照品作对照，以三氯甲烷-甲醇（1:1）为溶剂进行提取，硅胶G薄层板上点样，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（15:10:3）为展开剂展开，紫外灯光（365 nm）下检视荧光斑点。结果采用薄层色谱法能够高效快速地排查茯苓山药片中是否非法添加化学药品格列本脲，在与格列本脲对照品色谱相应的位置上，未显相同颜色的荧光斑点为阴性（样品不含格列本脲），显示相同颜色的荧光斑点为阳性（样品含格列本脲）。结论所建立的方法操作简便，且稳定性和重现性好，结果比较准确，适用于对茯苓山药片中的格列本脲的快速筛查。

【关键词】茯苓山药片；格列本脲；非法添加；薄层色谱

【中图分类号】R927.1

【文献标志码】A

【文章编号】1673-5846(2015)10-0019-04

【Abstract】Objective To establish a Thin Layer Chromatography(TLC)method for rapid determination of glibenclamide illegally added in Fulingshanyao Tablets.Methods Use glyburide as comparison,Use Chloroform-methanol(1:1)as extraction solvent,Spot sample on Silica gel G thin plate,Extract with chloroform-methanol-formic acid(15:10:3), Observe Fluorescent spots under UV light(365 nm).Results TLC method can efficiently determine whether there is glibenclamide illegally added in Fulingshanyao Tablets.The result is negative if there is no fluorescent spot with the same color of glyburide in the corresponding chromatographic position(there is no glyburide in the sample),The result is positive if there is fluorescent spot with the same color of glyburide in the corresponding chromatographic position(there is glyburide in the sample).Conclusion The method established is simple, stable and reproducible,the result is accurate,and it can be used for rapid determination of glibenclamide in Fulingshanyao Tablets

idRap Determination of Glibenclamide Illegally Added in Fulinshanyao Tablets

Nie Ying Pei Mingri Luan Guohua

【Key words】Chinese yam;Glyburide;Illegally added;Thin layer chromatography

茯苓山药片为市场上的一种降糖类保健食品，为棕黄色，味略苦。该药品说明中标示“本品是以茯苓、山药、葛根、玉竹、枸杞子等二十六味名贵药材配伍，采用高科技生物技术‘膜分离提取技术’工艺生产的新一代高效无毒副作用，又能对糖尿病患者健脾、益肾、补肝、明目、润肺的新一代绿色纯天然药食同疗制剂”。服用该药品后能快速降低血糖，采用薄层色谱法对茯苓山药片中是否非法添加化药降糖成分进行筛查分析，以多种化学降糖药为对照检测，鉴别结果显示，茯苓山药片中检出降糖化成分格列本脲，进一步采用高效液相色谱法（HPLC）DAD检测器检测验证，其添加化学药品的成分确实为格列本脲。格列本脲为第二代磺脲类降糖化学药品，有较强的降低血糖作用，临床适用于2型糖尿病病情较重的患者。由于急速降糖可导致患者产生严重低血糖，造成休克、诱发脑出血等生命危险，因此糖尿病患者应在医师指导下合理使用，以确保群众使用安全有效。本研究采用薄层及液相色谱法对茯苓山药片中添加化学药品成分进行了方法学的研究，建立薄层检测法，使茯苓山药片质量可控。

1　仪器与试剂

1.1 仪器 HPLC：安捷伦1100型LC（包括脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器，仪器编号：YYX-ZY2-009）；分光光度计：Agilent UV-8453型紫外分光光度计（美国安捷仑公司，仪器编号：YZW-HX-001）；紫外光灯；超声清洗器：JCX-600Z（山东济宁超声电子仪器厂，仪器编号：YZW-HX-003）；电子天平：METTLER AE-240型（仪器编号：YYT-ZY2-008）

1.2 材料实验样品：茯苓山药片，美国希美（国际）生物集团·希美（郑州）生物技术有限公司，规格：300 mg/片，60片/盒，铝塑板，批号：20110301、20120109；格列本脲对照品：中国食品药品生物制品检定研究院，批号：100135-200404（供含量测定使用），规格：50 mg/支；薄层板：硅胶G薄层快检板规格5 cm×10 cm（天津，由中检所提供）、硅胶G预制板：规格10 cm×10 cm（青

岛海洋化工厂）。

1.3 试剂甲醇（加拿大）色谱纯；甲醇（天津市化学试剂，批号：20120523）分析纯；三氯甲烷（北京化学试剂厂，批号：20120523）分析纯；甲酸（天津市光复精细化工研究所，批号：20120123）分析纯；乙酸乙酯（天津化学试剂厂，批号：20121221）；石油醚（天津化学试剂有限公司，批号：20110728）；乙酸铵（天津化学试剂有限公司，批号：20121020）分析纯；乙酸（北京北化精细化学品有限责任公司，批号：20120622）分析纯；实验用水为纯化水。

2　方法与结果

2.1 薄层色谱法（TLC）

2.1.1 溶液的制备供试品溶液的制备：取茯苓山药片5片，研细，称取细粉约1 g（相当3片重量），加提取溶剂甲醇-三氯甲烷（1:1）5 ml，超声提取10 min，静置，倾取上清液作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：取格列本脲对照品适量约25mg，精密称定，置于10 ml容量瓶中，加溶剂甲醇-三氯甲烷（1:1）约5 ml，超声10 min使对照品溶解，再加甲醇-三氯甲烷（1:1）至刻度，制成每1毫升含2.5 mg的对照品溶液。

阴性对照溶液的制备：取阴性对照样品（未加格列本脲）5片，研细，称取细粉约1 g（相当3片重量），加甲醇-三氯甲烷（1:1）5 ml，超声提取10 min，静置，倾取上清液作为供试品阴性对照溶液。

2.1.2 薄层鉴别方法粗放性考察

2.1.2.1 薄层板的比较 ①薄层快检板（天津，由中检所提供），按照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥB）实验，吸取上述配制的3种溶液各5 μl分别点于同一硅胶G薄层板上，通过三氯甲烷-甲醇-甲酸（15:10:3）展开剂展开，取出晾干，立即置于紫外光灯（254 nm）下检视。②薄层预制板（青岛海洋化工厂），吸取上述配制的3种溶液各10 μl，分别点于同一的硅胶G薄层板上，通过三氯甲烷-甲醇-甲酸（15:10:3）为展开剂展开，取出晾干，立即置于紫外光灯（254 nm）下检视。两种板比较结果显示：供试品（非法添加格列本脲）溶液所显荧光斑点颜色和位置与对照品溶液所显的荧光斑点相同，斑点清晰，分离度较好。快检板、预制板两种薄层板的分离效果相似，区别不大（Rf值适中）；快检板比预制板点样量少，快检板层析展开比较快，节省实验时间。

2.1.2.2 展开系统的优选参考有关资料[1-2]，在降糖类化学药品鉴别法中常用薄层展开系统进行比较：展开剂①石油醚（90～120℃）-乙酸乙酯-三氯甲烷-甲醇-甲酸（10:10:6:2:0.5），展开剂②三氯甲烷-甲醇-甲酸（15:10:3），分别取格列本脲、格列吡嗪、格列奇特、格列喹酮为对照，对照品之间及样品的分离度为判定指标，分别在两个展开系统下进行实验比较。结果显示：对照品之间能够很好地分离，样品在两个展开系统中的区别不大，两种展开系统下展开均可行，以展开剂②结果更佳。故选三氯甲烷-甲醇-甲酸（15:10:3）为展开剂。

2.1.2.3 实验环境的考察在3种不同温度（T）、相对湿度（RH）环境下比较：分别在高温（T 35℃、RH 50%）、低温（T 12℃、RH 25%）、室温（T 20℃、RH 40%）的条件下对该品种进行实验考察。结果显示：通过采用不同温度、相对湿度等综合考察薄层鉴别温度越高，对照品、样品中格列本脲绝对Rf值越大，在3种不同温、相对湿度下比较存在一定差异。高温、室温实验条件下分离度很好，斑点清晰；而低温下分离度较差，因此需控制TLC的实验条件，才能保证较好的重现性，保证快检结果的准确。

2.1.3 薄层实验方法薄层板：硅胶G254 nm薄层板（快检板）5 cm×10 cm，展开剂：三氯甲烷-甲醇-甲酸（15:10:3），点样量：吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各5 μl，检视：置紫外光灯（254 nm）下检视。结果显示：供试品溶液的色谱中，在与格列本脲对照品色谱相应的位置上，不得显示相同颜色的荧光斑点；阴性对照样品的色谱中，在与格列本脲对照品色谱相应的位置上，未见相同颜色的荧光斑点。茯苓山药片供试品色谱中，在与格列本脲对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的荧光斑点，说明样品中可能添加化学降糖药物格列本脲。经液相色谱法进一步验证此成分确实为格列本脲。见图1。

图1　茯苓山药片薄层鉴别色谱图

2.2 HPLC

2.2.1 格列本脲对照品贮备溶液精密称取格列本脲对照品25 mg，置于25 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成每1毫升含1 mg的对照品贮备溶液。

2.2.2 对照品溶液的制备取上述格列本脲对照品贮备溶液5 ml，置于50 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度制成浓度为每1毫升含0.1 mg对照品溶液。

2.2.3 样品溶液的制备取茯苓山药片10片，研细，称取约1.5 g（相当5片重量，即1次服用量）细粉，精密称定，加甲醇30 ml，超声处理30 min，

滤过，取滤液置蒸发皿中，将其置于水浴上蒸干，残渣加甲醇适量溶解，转移至25 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为样品溶液。

2.2.4 阴性对照溶液的制备取阴性对照（未含格列本脲样品）10片，研细，取约1.5 g（相当5片重量）细粉，精密称定，加甲醇30 ml超声处理30 min，滤过，滤液置蒸发皿中将其置于水浴上，蒸干，残渣加甲醇适量溶解，转移至25 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为阴性对照样品溶液。

2.3 系统适用性试验

2.3.1 检测波长的确定取上述配制的格列本脲对照品贮备溶液5 ml，置于50 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度制成浓度为每1毫升含0.1 mg对照品溶液，用紫外分光光度仪在200～400 nm范围内进行光谱扫描。结果显示：格列本脲对照品溶液在230 nm处有最大吸收。根据光谱扫描结果及参考有关格列本脲文献[3-5]，采用HPLC检测茯苓山药片中格列本脲，选用最大吸收波长λmax=230 nm作为检测波长。见图2。

2.3.2 干扰实验取阴性对照（未含格列本脲）样品，加格列本脲对照品适量，加甲醇制成每1毫升含0.1 mg格列本脲的样品溶液，滤膜滤过，即得，自动进样测定。结果显示无干扰。

参考文献2.3.3 流动相的选择[1-2]采用A：0.02 mol/L磷酸二氢钾（pH 3.5）-甲醇（30:70）为流动相，B：0.05 mol/L乙酸铵-乙腈为流动相，进行梯度洗脱，流动相B分离效果好，保留时间适度，故选择流动相B为本法的流动相。理论板数（N）的确定，采用色谱柱：①Apollo C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），②Shim-pack VP-ODS C18（150 mm ×4.6 mm，5 μm），③Alltima ODS C18（150 mm ×4.6 mm，5 μm），流速：0.8 ml/min；3种色谱柱比较结果显示，色谱柱③条件下，供试品中格列本脲保留时间、理论板数以格列本脲峰计理论板数（N）大于2000时，分离度（R）≥1.5。故理论板数以格列本脲峰计应不低于1000。

2.3.4 液相色谱条件色谱柱：Apollo C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm），流动相：A相:乙腈，B相：0.05 mol/L乙酸铵-乙腈（梯度洗脱），进样量：20 μl，柱温：30 ℃，流速：0.8 ml/min，检测波长：230 nm。依照上述方法，测得格列本脲对照品溶液、样品溶液。

2.3.5 检测结果取格列本脲对照品溶液、样品溶液（非法添加格列本脲）及阴性对照样品溶液（未含格列本脲）各20 μl，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行实验，记录色谱图。阴性样品（未含加格列本脲）溶液色谱图在与格列本脲对照品色谱峰保留时间相应的位置上未出现色谱峰。样品（非法添加格列本脲）溶液主峰保留时间与格列本脲对照品色谱峰保留时间相同；经二极管阵列（DAD）检测器检测验证，样品的确非法添加了格列本脲（图3～5）。