BMSCs对糖尿病肾病大鼠的治疗作用及机制探讨

张袁，高克瑜，戴春

(1徐州医学院研究生学院，江苏徐州221000；2 徐州医学院附属医院)



BMSCs对糖尿病肾病大鼠的治疗作用及机制探讨

张袁1，高克瑜1，戴春2

(1徐州医学院研究生学院，江苏徐州221000；2 徐州医学院附属医院)

摘要：目的观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)对糖尿病肾病(DN)大鼠的治疗作用，并探讨其作用机制。 方法将20只DN造模型成功大鼠随机分为观察组和对照组各10只，分别于造模4周尾静脉输注BMSCs、生理盐水；另选10只正常大鼠作为空白组，不做任何处理。造模12周，检测各组24 h尿蛋白定量、血肌酐(Scr)、血糖、裂孔隔膜蛋白(nephrin)和肌间线蛋白(desmin)水平。结果与空白组比较，对照组及观察组血糖、24 h尿蛋白量、 Scr和desmin表达升高，nephrin表达减少(P均<0.05)；与对照组比较，观察组24 h尿蛋白量、 Scr和desmin表达降低，nephrin表达增加(P均<0.05)。结论BMSCs对DN大鼠肾脏具有治疗作用，可能与其改善足细胞EMT有关。

关键词：糖尿病肾病； 骨髓间充质干细胞； 上皮间充质转分化;足细胞；裂孔隔膜蛋白；肌间线蛋白

糖尿病肾病(DN)是糖尿病患者的常见并发症，是导致终末期肾病(ESRD)的最主要病因。研究发现，足细胞损伤在DN的发生、发展中起关键作用[1]。上皮间充质转分化(EMT)是DN足细胞损伤的早期事件，表现为上皮细胞标志物如裂孔隔膜蛋白(nephrin)水平降低，间充质细胞标志物如肌间线蛋白(desmin)水平升高，导致细胞足突融合，肾小球滤过屏障受损，最终导致尿蛋白水平增高[2]。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一种具有多项分化潜能的干细胞，在体内能趋化、归巢至受损组织中，分化或修复组织[3]。研究发现，BMSCs可延缓DN病情进展、降低蛋白尿，但具体机制尚不清楚[4]。2014年6～12月，我们观察了BMSCs对DN大鼠的治疗作用，并探讨其作用机制。现报告如下。

1材料与方法

1.1材料大鼠BMSCs由本实验室培养。8周龄健康SPF级雄性SD大鼠38只，体质量200～250 g，购自徐州医学院动物实验中心。链脲佐霉素(STZ，Sigma)；胎牛血清(杭州四季青)；改良Eagle培养基(北京赛默)；CD90-FITC(Biolegend)、CD29-FITC、CD45-PE (Ebioscience)；兔抗大鼠nephrin多克隆抗体(武汉博士德)；兔抗大鼠desmin多克隆抗体(无锡药科美生物科技有限公司)；羊抗兔二步法免疫组化试剂盒(二抗)；IRDyeTM800 标记的山羊抗兔抗体(二抗)。

1.2分组与处理取28只大鼠根据文献[5,6]采用STZ 55 mg/kg一次性腹腔注射方法制作糖尿病模型。造模3 d后连续3 d尾静脉检测血糖，血糖均>16.7 mmol/L则造模成功。造模后4周若大鼠尿量>原尿量150%、尿蛋白>30 mg/24 h尿则视为DN模型造模成功。最终造模成功20只，随机分为观察组和对照组各10只，另选10只健康大鼠为空白组。观察组于DN造模成功4周时通过尾静脉输注BMSCs2×106，对照组同时尾静脉注射生理盐水1 mL，空白组不做任何处理。

1.3 24 h尿蛋白量、血糖、血肌酐(Scr)测定干预8周后检测24 h尿蛋白量、血糖、Scr。

1.4肾组织足细胞nephrin、desmin检测采用Western blot法。各组大鼠断头处死后取部分肾脏组织，电泳、转膜、牛奶封闭后加入兔抗大鼠nephrin、desmin抗体。4 ℃孵育24 h，加入二抗(1∶1 000 IRDyeTM800 标记的山羊抗兔抗体)，室温避光孵育2 h, Odyssey激光成像系统扫描，图像用Image J软件分析。以β-actin作为内参照，测定蛋白的相对表达量。

2结果

2.1各组24 h尿蛋白量、血糖、Scr比较见表1。

表1　各组24 h尿蛋白量、血糖、Scr比较

注：与空白组比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05。

2.2各组足细胞nephrin、desmin表达比较见表2。

表2　各组足细胞nephrin、desmin表达比较

注：与空白组比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05。

3讨论

足细胞损伤是DN早期重要病理特征[1]，蛋白尿形成与足细胞损伤密切相关[7,8]。近年研究认为，EMT在DN足细胞损伤中发挥重要作用[9,10]。足细胞是一种高度特异、终末分化的肾小球脏层上皮细胞，是由后肾中胚层的间充质细胞向上皮细胞转分化发育而来，并通过以肌动蛋白为主的细胞骨架系统和足细胞特异表达的蛋白分子，在肾小球结构和功能上发挥着重要作用。研究发现，炎症、缺血缺氧、高血糖、全身免疫系统疾病等因素均可导致肾脏细胞内环境的改变，使得转分化因子与逆转分化因子之间失去平衡，导致EMT[11，12]，从而导致肾小球滤过屏障受损，尿蛋白水平升高，肾小球硬化[2,9,10]。足细胞表型即足细胞成熟的蛋白标志物，包括足细胞表面蛋白分子和nephrin分子。nephrin是维持裂孔膜完整性的不可缺少的分子。细胞发生EMT时，将失去成熟足细胞的上皮细胞样表型标志物如nephrin、紧密连接蛋白-1、P钙黏蛋白等，而表达上调间充质细胞样表型标志物如desmin、成纤维细胞特殊蛋白-l、整合素连接激酶、细胞外基质纤维连接蛋白、胶原I和基质金属蛋白酶9等[13]。

BMSCs是一类具有自我更新、多向分化潜能、免疫调节和低免疫原性的细胞，具有向骨、软骨、肌肉、脂肪等多向分化能力[3，14]。实验表明，BMSCs可向肾实质细胞转化，以往广泛用于各种肾病模型的实验研究[15]。近来研究发现，在阿霉素[16]和氨基核苷嘌呤霉素诱导的肾病模型中给予BMSCs可明显降低蛋白尿水平，减轻足细胞损伤。在1型和2型糖尿病动物模型中给予BMSCs同样可显著降低蛋白尿水平，减轻足细胞的损伤和丢失[4,14]。本研究发现，对照组足细胞上皮细胞标志蛋白nephrin表达明显降低，间充质细胞标志蛋白desmin表达明显升高，提示DN大鼠足细胞存在EMT过程。同时本研究还发现，BMSCs能明显改善足细胞上述病理变化降低蛋白尿，而对血糖水平无明显改善作用。提示BMSCs对DN有一定治疗作用，且该作用独立于降糖作用之外，可能与降低足细胞EMT过程有关。

参考文献：

[1] Li JJ, Kwak SJ, Jung DS, et al. Podocyte biology in diabetic nephropathy[J]. Kidney Int Suppl, 2007(106):36-42.

[2] Li Y, Kang YS, Dai C, et al. Epithelial-to-mesenchymal transition is a potential pathway leading to podocyte dysfunction and proteinuria[J]. Am J Pathol, 2008,172(2):299-308.

[3] Charbord P. Bone marrow mesenchymal stem cells: historical overview and concepts[J]. Hum Gene Ther, 2010,21(9):1045-1056.

[4] Zhou H, Tian HM, Long Y, et al. Mesenchymal stem cells transplantation mildly ameliorates experimental diabetic nephropathy in rats[J]. Chin Med J (Engl), 2009,122(21):2573-2579.

[5] Chow BS, Allen TJ. Mouse Models for Studying Diabetic Nephropathy[J]. Curr Protoc Mouse Biol, 2015,5(5):85-94.

[6] Tesch GH, Allen TJ. Rodent models of streptozotocin-induced diabetic nephropathy[J]. Nephrology (Carlton), 2007,12(3):261-266.

[7] Ziyadeh FN, Wolf G. Pathogenesis of the podocytopathy and proteinuria in diabetic glomerulopathy[J]. Curr Diabetes Rev, 2008,4(1):39-45.

[8] Wolf G, Ziyadeh FN. Cellular and molecular mechanisms of proteinuria in diabetic nephropathy[J]. Nephron Physiol, 2007,106(2):26-31.

[9] Yamaguchi Y, Iwano M, Suzuki D, et al. Epithelial-mesenchymal transition as a potential explanation for podocyte depletion in diabetic nephropathy[J]. Am J Kidney Dis, 2009,54(4):653-664.

[10] Reidy K, Susztak K. Epithelial-mesenchymal transition and podocyte loss in diabetic kidney disease[J]. Am J Kidney Dis, 2009,54(4):590-593.

[11] Savagner P. The epithelial-mesenchymal transition (EMT) phenomenon[J]. Ann Oncol, 2010(21)：89-92.

[12] 周虹,高斌,田浩明.骨髓间充质干细胞指标倒数糖尿病肾病初探[J].四川大学学报(医学版), 2009,40(6):1024-1028.

[13] Lamouille S, Xu J, Derynck R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2014,15(3):178-196.

[14] Wang S, Li Y, Zhao J, et al. Mesenchymal stem cells ameliorate podocyte injury and proteinuria in a type 1 diabetic nephropathy rat model[J]. Biol Blood Marrow Tran, 2013,19(4):538-546.

[15] Zou J, Xu LR, Wang XC. Dynamical distribution of bone marrow mesenchymal stem cells in rat model of chronic aristolochic acid nephropathy[J]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi, 2009,29(7):636-638.

[16] Sarhan M, El Serougy H, Hussein AM, et al. Impact of bone-marrow-derived mesenchymal stem cells on adriamycin-induced chronic nephropathy[J]. Can J Physiol Pharmacol,2014,92(9):733-743.

收稿日期：(2015-07-19)

通信作者：戴春

中图分类号：R587.2

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)46-0030-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.46.011