齐墩果酸对小鼠急性肝脏氧化损伤治疗作用研究

郗艳丽，郑晓娟，魏振奇，刘　敏，葛红娟，宋春梅

(吉林医药学院公共卫生学院，吉林 吉林　132013)

·论著·

齐墩果酸对小鼠急性肝脏氧化损伤治疗作用研究

郗艳丽，郑晓娟，魏振奇，刘敏，葛红娟，宋春梅*

(吉林医药学院公共卫生学院，吉林 吉林132013)

摘要：目的建立肝脏急性氧化损伤模型，观察齐墩果酸对小鼠肝脏氧化损伤的治疗作用。方法3 mL/kg四氯化碳(CCl4)腹腔注射，24 h后给予齐墩果酸灌胃，干预2 d后处死小鼠。检测肝脏脏器系数、病理改变、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量。结果齐墩果酸未拮抗CCl4引起的SOD含量降低以及MDA含量升高(P>0.05)，也未能减轻小鼠肝组织的损伤程度。结论CCl4诱导小鼠急性肝脏氧化损伤以后，再给予齐墩果酸治疗，效果不佳。

关键词：齐墩果酸；氧化损伤；治疗作用

文章编号：1673-2995(2015)02-0081-03

中图分类号：R285.5

文献标识码：识码： A

Abstract:ObjectiveTo establish an acute liver oxidative damage model and investigate the therapeutical effects of oleanolic acid on mouse modell. MethodsThe mice were injected with carbon tetrachloride at the dose of 3 mL/kg.After 24 hours,they were gavagedwith oleanolic acid once every day. After Two days,the mice were sacrificed to measure their liver indexes,pathological changes,superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) content in liver. ResultsOleanolic acid treatment exhibited no significant inhibition effect on the decrease in SOD activity and increase in MDA content(P>0.05),and failed to reduce the extent of damage in liver. ConclusionIt is anineffective treatment with oleanolic acid for CCl4-induced acute liver oxidative damage in mice.

基金项目：吉林省大学生创新创业训练计划项目.

作者简介：郗艳丽(1981-)，女(汉族)，讲师,博士.

通讯作者：宋春梅(1964-)，女(汉族)，教授，硕士.

收稿日期：( 2014-11-04)

Therapeutical effects of oleanolic acid on acute liver oxidative damage in mice

XI Yanli,ZHENG Xiaojuan,WEI Zhenqi,LIU Min,GE Hongjuan,SONG Chunmei*(School of Public Health,Jilin Medical College,Jilin City，Jilin Province,132013，China)

Key words: oeanolic acid;oxidative damage;terapeutical effects

急性肝损伤是各种原因引起的肝功能异常，严重的肝损伤会导致肝功能衰竭。引起肝急性损伤的原因很多，主要有用药不当、食品添加剂使用不当、乙醇摄入过多、病毒感染等。氧化应激是诱发肝损伤的主要原因之一。有效的预防和治疗氧化损伤的药物，可以避免患者发生肝脏衰竭，保护肝脏，甚至可以帮助患者迅速恢复肝脏功能，预防后遗症。齐墩果酸(oleanolic acid，OA)为五环三萜类化合物，主要来源于木犀科植物齐墩果的叶[1]。女贞子的果实也含有丰富的齐墩果酸[2]。目前已经证实，齐墩果酸有抗氧化损伤的作用[3-5]。本研究采用四氯化碳(CCl4)制备肝急性氧化损伤模型，进一步探讨齐墩果酸对肝急性氧化损伤的治疗作用及相关机理。

1材料与方法

1.1　试剂与仪器

齐墩果酸来源于西安文竹生物科技有限公司(HPLC≥98%)，临用时称取3 g齐墩果酸溶解于10 mL豆油中，置37 ℃水浴超生30 min，制成浓度为300 mg/mL的齐墩果酸豆油混悬液。CCl4、邻苯三酚、盐酸、硫代巴比妥酸、三氯醋酸均购于天津市凯信化学工业有限公司。三氯醋酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-盐酸(HCl)混合液的配置：称取TCA 15 g,TBA 0.375 g，2.5 mol/mL HCl 10 mL加蒸馏水至100 mL，在50 ℃左右的水浴中溶解，现用现配。

TDZ5-WS离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)，BS224S电子天平(北京赛多利斯)，722型分光光度计(中国厦门分析仪器厂)，DY89-Ⅱ电动玻璃匀浆器(宁波新芝生物科技股份有限公司)，尼康正置显微镜(NIU)。

1.2　动物分组及给药方法

健康雄性SPF级ICR小鼠30只，4~5周龄，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司[许可证号：SCXK(吉)-2011-0004]。动物采购后，置于实验室适应1周，给予充足的食物和水。

随机分成3个实验组，分别为对照组、染毒组、齐墩果酸治疗组，每组动物数为10只。对照组先给予3 mL/kg生理盐水腹腔注射一次，24 h后给予豆油灌胃，1次/d，共干预2 d，灌胃剂量为0.1 mL/100 g。染毒组给予CCl4原液皮下注射一次，给予剂量为3 mL/kg，24 h后给予豆油灌胃，1次/d，共干预2 d，灌胃剂量为0.1 mL/100 g。齐墩果酸治疗组先皮下注射3 mL/kg CCl4原液，24 h后给予齐墩果酸灌胃,1次/d，共干预2 d，灌胃剂量为0.1 mL/100 g。给水，禁食24 h,颈椎脱臼处死小鼠，取肝脏备用。

1.3　肝脏脏器系数

准确称取肝脏湿重，按照公式计算肝脏的脏器系数：肝脏湿重(g)/体重(g)×100%=脏器系数。

1.4　肝组织病理学检测

切取肝脏左叶置于10%甲醛固定液中，固定24 h后进行常规的HE染色。

1.5　肝组织SOD含量的检测

准确称取肝组织0.5 g，加9倍生理盐水，制成10%匀浆，2 500 rpm，离心10 min，取上清，邻苯三酚法测定组织匀浆中的SOD含量。

1.6　肝组织MDA含量测定

准确称取肝组织0.5 g，加入9倍体积的150 mmol/L KCl溶液，制成10%匀浆，2 500 rpm，离心10 min，取上清，置于4℃冰箱中待测。取2支试管,样品管加1 mL匀浆液,2 mL TCA-TBA-HCl;空白管加1 mL KCl,2 mL TCA-TBA-HCl,混匀后，加塞，置于沸水浴中煮沸15 min，取出后立即冷却至室温。经4 000 rpm离心10 min，取上清于535 nm波长处比色测定，以空白管调零。

1.7　统计学处理

数据采用SPSS 13.0软件及EXCEL2007进行处理分析。

2结果

2.1　齐墩果酸对急性肝脏氧化损伤小鼠肝脏脏器系数

由图1可知，染毒组的肝脏脏器系数明显高于对照组，经t检验其差异有统计学意义(P<0.05)，说明CCl4对小鼠的肝脏有毒性作用。齐墩果酸治疗组的肝脏脏器系数高于对照组，经t检验其差异有统计学意义(P<0.05)。此外，治疗组的肝脏脏器系数也明显高于染毒组，经t检验其差异无统计学意义(P>0.05)。这一结果表明齐墩果酸对CCl4所致的小鼠急性毒性作用的治疗作用不明显，在CCl4引起急性损伤后给予齐墩果酸进行治疗，达不到理想的治疗效果。相反，可能会导致损伤进一步加重。

(与对照组比较，*P<0.05)

2.2　齐墩果酸对急性肝脏氧化损伤小鼠肝脏病理改变

从图2可见，对照组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列，肝血窦清晰可见，未见淤血或扩张。染毒组细胞排列紊乱，细胞质染色异常，细胞肿胀，细胞间界限不清。齐墩果酸治疗组可见肝细胞核固缩，胞质浓缩，有空泡变性。

A:对照组；B:染毒组；C:OA治疗组

2.3　齐墩果酸对急性肝脏氧化损伤小鼠肝脏SOD含量的影响

小鼠肝脏SOD含量检测结果显示(见图3)，染毒组肝脏SOD的含量与对照组相比有降低的趋势，经t检验分析其差异有统计学意义(P<0.05)，齐墩果酸治疗组肝脏SOD含量与对照组相比也有降低的趋势，经t检验分析其差异有统计学意义(P<0.05)。齐墩果酸治疗组肝脏SOD含量与染毒组比较无明显差异(P>0.05)。CCl4引起肝脏急性氧化损伤之后，再一次大剂量给予齐墩果酸治疗，无法在短时间快速地清除损伤。

2.4　齐墩果酸对急性肝脏氧化损伤小鼠肝脏MDA含量影响

小鼠肝脏MDA含量检测结果表明(见图4)，与对照组相比，染毒组和齐墩果酸治疗组小鼠肝脏MDA含量都明显增加。齐墩果酸治疗组MDA含量增加的更加明显，且染毒组与对照组MDA含量比较，其差异有统计学意义(P<0.05)，齐墩果酸组与对照组比较，其差异也有统计学意义(P<0.05)。但是齐墩果酸治疗组与染毒组MDA含量比较，其差异无统计学意义(P>0.05)。这一结果表明齐墩果酸对CCl4导致的急性肝脏氧化损伤的治疗作用不明显，或者根本没有治疗作用。

(与对照组比较，*P<0.05)

图 3OA对急性肝脏氧化图 4OA对急性肝脏氧化

SOD损伤小鼠肝脏损伤小鼠肝脏MDA

含量的影响 含量的影响

3讨论

CCl4经肝微粒体细胞色素P-450催化发生一电子还原，脱卤生成三氯甲烷自由基(·CCl3)，·CCl3作用于生物膜，引起生物膜不饱和脂肪酸过氧化，改变了生物膜的流动性和通透性，胞质内Ca2+浓度升高，破坏细胞骨架，引起肝细胞损伤和坏死。本研究利用CCl4一次大剂量给予的方法制备小鼠急性肝脏氧化损伤模型，经肝脏脏器系数及组织病理学检测发现模型组肝脏发生水肿变性。SOD是自由基清除剂，MDA是脂质过氧化损伤的重要标志。SOD水平降低、MDA含量水平升高表明机体受到自由基的侵害，出现了氧化损伤。本研究通过对SOD及MDA含量检测，发现染毒组肝脏已经受到了氧自由基的损伤。上述结果表明，本研究利用CCl4诱导急性肝脏氧化损伤小鼠模型造模成功。

齐墩果酸有抗氧化、清除自由基的功效，对肝脏有一定的保护作用。有研究表明，提前给予齐墩果酸一次，可以保护CCl4导致大鼠的肝脏氧化损伤[6]。CCl4与齐墩果酸的不同给药顺序，可能会影响其干预效果。本课题组已经证实，损伤之前给予齐墩果酸，可以起到保护小鼠肝脏、清除自由基的作用[7]。本研究在CCl4腹腔注射24 h以后，立即给予受试小鼠齐墩果酸灌胃，观察其对CCl4引起肝脏损伤的治疗效果。齐墩果酸治疗组的检测结果表明，造模成功后再给予齐墩果酸灌胃，无法达到预期的治疗效果，对肝脏没起到保护作用。SOD和MDA含量检测结果表明，齐墩果酸治疗组与染毒组比较，差异没有统计学差异(P>0.05)。这表明齐墩果酸对CCl4导致的氧化损伤虽然没起到治疗作用，但也没造成进一步、更严重的损伤。

参考文献：

[1]孔阳，马养民.大孔树脂分离纯化女贞子中齐墩果酸工艺的研究[J].陕西科技大学学报:自然科学版，2012,30(4):57-60.

[2]张蜀艳，李政.齐墩果酸研究进展[J].食品与发酵科技，2010,46(4)：22-24.

[3]戴云，邱晓燕，何耀莹，等.齐墩果酸和熊果酸对DPPH自由基的清除作用[J].云南民族大学学报:自然科学版，2012,21(6):395-398.

[4]高大威，李青旺，刘志伟，等.女贞子中齐墩果酸抗糖尿病效果研究[J].中成药，2009,31(10):1619-1621.

[5]魏海珍，张秀峰.齐墩果酸对损伤血管内皮细胞的保护作用及其机制探讨[J].南京医科大学学报:自然科学版，2012,32(11):1505-1510.

[6]Liu Yaping，Hartley DP，Liu Jie.Protection against carbon tetrachloride hepatotoxicity by oleanolic acid is not mediated through matallothionein[J].Toxicol Lett,1998,95(2):77-85.

[7]郗艳丽，吴启坤，冯威，等.齐墩果酸对CCl4诱导小鼠急性肝损伤保护作用的实验研究[J].吉林医药学院学报,2015,36(1):1-3.