家蚕白僵病抗性检测平台的建立

邢东旭 李庆荣 肖阳 叶明强 杨琼

（广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东广州 510610）

省力化养蚕是当前蚕桑产业发展的现实需求，抗性家蚕品种的应用是实现省力化养蚕的重要途径。近年来，华康2号、桂蚕N2等抗家蚕核型多角体病毒病的选育成功，表明利用家蚕抗性品种资源改良品种抗性具有较大的潜力[1-3]。开展抗性品种选育，首先需要建立一套可靠的检测技术平台，确保调查数据真实可靠、结果可重复。然而，对于家蚕真菌病的抗性检测，目前国内尚未有统一规范的检测标准。此外，白僵菌是重要的生防菌株，在农业、林业病虫害防治上具有较高的应用价值[4-5]。通过对各种白僵菌菌株进行毒力检测，从而筛选到高致病力的白僵菌也具有较大意义，这同样需要一套实用的检测方法。因此，项目组通过系统研究，摸索出了一套科学、稳定测定家蚕白僵病的抗检测技术平台。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试家蚕品种为湘A、春5和抗8，供试病原为球孢白僵菌，均由本实验室继代保存。

1.2 实验方法

1.2.1 抗性检测平台的建立

以浸浴攻毒法作为白僵菌感染家蚕的方法。在此基础上对病原制备、家蚕选择、浸浴攻毒、养蚕环境、数据调查等主要技术环节制定具体操作标准，建立抗性检测技术规程。

1.2.2 检测方法的实验误差分析

利用新建立的检测平台对3个家蚕品种进行抗性测定，于4龄起蚕进行攻毒，接种病原浓度为103个/mL。每个品种设3区重复，每区30头。统计发病率，以各品种死亡率的标准差反映该方法的重复性和实验误差。同时将上述家蚕品种进行体喷法攻毒作为对照，以此对比两种方法重复性的差异。

2 实验结果与分析

2.1 抗性检测流程与技术规范

2.1.1 病原制备

将供试白僵菌菌株用PDA培养基在26℃、RH 95%的培养箱中培养15d。用含0.2%吐温80的无菌水溶液冲洗平板表面，孢子液用纱布过滤、离心，然后用含0.2%吐温80的无菌水将病原调整到实验需要的浓度，于半日内使用。

此外，病原也可直接从蚕体分离，获得的孢子粉经冷冻干燥后于低温保存备用。病原使用前进行活孢率检测。具体测定方法如下：配制1×107个/ml的孢子液，取1 ml孢子液与9 ml营养液（含2%蔗糖、0.5%蛋白胨）混合，于26±1℃振荡（150 r/min）24 h，然后通过血球计数板计数，计算活孢率。根据活孢率对孢子液浓度进行校正。

2.1.2 家蚕选择标准

选择4龄或5龄起蚕用于试验。另外，家蚕刚眠起时体壁嫩薄，多褶皱，白僵菌容易粘附和穿透。如试验用蚕个体间体壁发育有差异，则影响试验结果的准确性。因此，一般选择眠起后8 h-12 h、大小匀一的起蚕。

2.1.3 浸浴攻毒

同一个试验区的家蚕放入一个球形滤网中，然后将滤网闭合。根据家蚕龄期、大小选择不同规格的滤网，保证滤网闭合后蚕体间不发生挤压刮伤。将病原液倒入烧杯，滤网浸没到病原液以下并不断摇动15 s，然后提起滤网将水沥干，把蚕转到铺好塑料蚕网的饲养盒内，并用不锈钢筷把蚕分开。更换病原液，开始下一区试验。攻毒1 h后给桑。

2.1.4 养蚕环境控制

白僵菌粘附到昆虫体表后，在适宜的温湿度下发芽长出芽管，然后借助芽管伸长的机械压力进入昆虫体内寄生。白僵菌生长的温湿度为：温度24℃-28℃、相对湿度 90%以上。攻毒后的蚕于生物培养箱或蚕室中饲养，各处理组和对照组家蚕均处于同样的温湿度环境中。

图1 家蚕白僵病抗性检测流程

2.1.5 数据调查

每天调查家蚕死亡情况。对出现的病死蚕及时拣出，虫尸保湿培养，观察是否有气生菌丝和分生孢子长出。对其它病症死亡的蚕进行镜检，确认发病原因。对调查数据进行整理、分析，统计发病率，分析试验蚕品种间的抗性差异。

2.2 实验误差分析

分别利用本抗性检测平台和体喷法两种方法对3个家蚕品种进行抗性检测。由图2可以看出，以该检测平台进行抗性检测，各品种死亡率的标准差均较小，表明调查数据在各重复区间基本一致，重复性较好，实验结果更为可靠。而且，在用于品种间抗性大小比较时能够得到更为准确的结果。如图2（左）所示，春5的抗性稍弱于抗8，而用体喷法则很难判定它们的抗性大小。

图2 两种不同检测方法获得的抗性调查数据比较

3 讨论与结论

开展抗性蚕品种选育，建立技术规范、数据可靠、结论可重复的检测方法是必要条件。不同于细菌和病毒，白僵菌主要经表皮感染，再穿透体壁进入蚕体内寄生。目前试验中白僵菌感染家蚕的主要方法是体喷法[6]，该方法存在的主要问题是：无法保证每条蚕接种的病原量一致，无法判断试验误差是来源于试验个体间抗性存在的固有差异还是由于蚕体病原量不一造成，给试验结果断定带来干扰；数据重复性不佳。

项目组建立了以浸浴攻毒为核心的抗性检测平台，通过对滤网和浸浴时间的规范，能够保证家蚕个体体表接触、粘附病原的机会是基本均等的。通过体喷法和本方法进行了试验误差比较，发现本方法的试验误差明显低于体喷法，各重复区数据具有更好的重复性，证实本检测平台具有较好的实用性、准确性和可靠性。

利用该检测平台，一方面可用于家蚕抗白僵病的抗性评价。本项目组对本单位保存的家蚕品种资源进行了白僵病抗性评价，筛选到数个对白僵病抗性较高的家蚕品种和敏感品种，为相关研究提供了品种素材。另一方面也可用于对白僵菌的毒力测定，从而发现优良的菌株。我们对从蚕区分离获得的白僵菌菌株进行毒力比较，筛选到一株对家蚕具高致病力的球孢白僵菌菌株[7]，在中药材白僵蚕的人工生产上具有极大的应用价值。

[1]徐安英,林昌麒,钱荷英,等.耐家蚕核型多角体病毒病蚕品种“华康2号”的育成[J].蚕业科学,2013,39(2):275-282.

[2]吴忠明,向志辉,韩世玉,等.耐家蚕核型多角体病毒蚕品种华康2号在黄平县试养初报[J].中国蚕业,2014,35(3):36-38.

[3]石美宁,闭立辉,顾家栋,等.家蚕抗血液型脓病新品种桂蚕N 2的选育[J].广西蚕业,2012,49(4):1-12.

[4]杜威,江萍,王彦苏,等.白僵菌施加对水稻三种抗氧化酶活力及叶际微生物多样性的影响[J].生态学报,2014,34(23):6975-6984.

[5]杜广祖,和淑琪,李正跃,等.几株球孢白僵菌对纵坑切梢小蠹毒力测定[J].中国森林病虫,2014,33(4):19-22.

[6]罗成，应盛华，冯明光.球孢白僵菌对斜纹夜蛾高毒菌株筛选与制剂的研发[J].中国生物防治学报,2011,27(2):188-196.

[7]邢东旭,李丽,廖森泰,等.一株感染家蚕的高致病性白僵菌的鉴定及在僵蚕生产中的应用[J].蚕业科学,2014,40(5):879-883.