碱预处理玉米芯米根霉同步糖化发酵产富马酸

2016-01-13顾夕梅,周瑾,陈云等

生物加工过程 2015年6期

顾夕梅,周瑾,陈云,李鑫

(南京林业大学化学工程学院，江苏南京210037)

摘要：以碱预处理玉米芯渣为原料，采用单因素优化方法优化米根霉同步糖化发酵产富马酸。在此基础上，研究米根霉利用碱预处理玉米芯渣的同步糖化发酵，并与纯糖发酵进行对比。结果表明：在50 g/L底物、(NH4)2SO4质量浓度0.71 g/L、纤维素酶用量20 FPIU(以1 g纤维素计)、CaCO3加入量30 g/L、接种量10%(体积分数)和装液量50 mL的条件下，米根霉同步糖化发酵过程产富马酸13.78 g/L，而纯糖发酵富马酸生成量仅6.21 g/L。

关键词：碱预处理；玉米芯渣；富马酸；同步糖化发酵；米根霉

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.06.003

收稿日期：2014-01-07

基金项目：国家科技支撑计划(2015BAD15B09)；江苏省高校自然科学研究重大项目(14KJA220003)；江苏省自然科学基金(BK20131426)

作者简介：顾夕梅(1991—)，女，江苏南通人，硕士研究生，研究方向：木质纤维原料生物利用；李鑫(联系人)，副教授，E-mail:xli@njfu.edu.cn

中图分类号：TQ353.6

文献标志码：A

文章编号：1672-3678(2015)06-0013-05

Abstract：Simultaneous saccharification and fermentation (SSF) of alkali-pretreated corncob to fumaric acid by Rhizopus oryzae was optimized. The optimal conditions were as follow:substrate loading 50 g/L,ammonium sulfate 0.71 g/L,cellulase dosage 20 FPIU/g cellulose,calcium carbonate 30 g/L,inoculum 10%(V/V),and loading volume 50 mL. Simultaneous saccharification and fermentation(SSF) of alkali-pretreated corncob to fumaric acid was compared to direct fermentation of glucose. Under the optimal conditions,process of SSF by Rhizopus oryzae could produce 13.78 g/L fumaric acid,while direct fermentation only obtained 6.21 g/L fumaric acid using glucose as the carbon source.

Keywords：alkali-pretreated； corncob; fumaric acid; simultaneous saccharification and fermentation; Rhizopus oryzae

Simultaneous saccharification and fermentation of alkali- pretreated corncob to fumaric acid by Rhizopus oryzae

GUXimei,ZHOUJin,CHENYun,LIXin

(CollegeofChemicalEngineering,NanjingForestryUniversity,Nanjing210037,China)

富马酸作为一种不饱和四元羧酸，含有不饱和双键及2个羧基，这样的分子结构，使其能够参与众多化学反应。同时，富马酸具有无毒、不吸湿及可增加聚合物坚硬度等特性，在食品、化工、医药、涂料、树脂等领域具有广泛用途[1-4]。

目前，化石资源的衰竭及化学合成法对环境的污染，使得微生物发酵产富马酸成为当前研究的热点之一。发酵法生产富马酸的微生物主要有霉菌、酵母及细菌，而根霉具有营养要求简单、环境适应能力强以及生长迅速等特点。此外，根霉菌可利用碳源范围较广，如葡萄糖、淀粉、纤维素和石蜡。以来源广泛的非粮食基木质纤维原料为碳源，低成本生物转化富马酸，符合可持续发展的要求。

同步糖化发酵(simultaneoussaccharificationandfermentation，SSF)技术将酶水解过程和发酵有机结合，具有缩短发酵周期、节约成本、避免底物抑制等优点[7-8]。笔者以米根霉为发酵菌种，利用碱预处理玉米芯渣为原料，SSF法产富马酸，并对影响发酵过程的因素进行优化，以确定最佳SSF条件。

1材料与方法

1.1　菌种和原料

米根霉(Rhizopus oryzae)CICC40351，购于中国工业微生物菌种保藏中心。

碱预处理玉米芯渣：江苏康维生物有限公司(纤维素质量分数66.35%，半纤维素质量分数22.38%，木质素质量分数5.92%)。

纤维素酶(Novozyme公司,滤纸酶活力为117U/g)、β-葡萄糖苷酶(Novozyme公司，酶活力为323U/g)，Sigma公司。

1.2　培养基

斜面培养基(g/L)：酵母膏3.0、麦芽浸膏3.0、琼脂20.0、蛋白胨5.0、葡萄糖10.0。

基础培养基(g/L)：葡萄糖40、(NH4)2SO44.4、KH2PO40.6、MgSO4·7H2O0.5、ZnSO4·7H2O0.017 6、FeSO4·7H2O0.000 498。pH2.3～2.7。

发酵培养基I(g/L)：(以葡萄糖为碳源)葡萄糖38、(NH4)2SO40.71、KH2PO40.6、MgSO4·7H2O0.5、ZnSO4·7H2O0.01、FeSO4·7H2O0.000 4。自然pH。

发酵培养基II(1L)：(以碱处理玉米芯渣为碳源)底物50g、(NH4)2SO40.71g、KH2PO40.6g、MgSO4·7H2O0.5g、ZnSO4·7H2O0.01g、FeSO4·7H2O0.000 4g、CaCO330g(单独灭菌)；纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的加入量分别为25IU和20IU(以1g纤维素计)；加入乙酸-乙酸钠缓冲液0.05mol/L维持发酵液pH4.8左右。

上述培养基均在0.1MPa、121 ℃条件下灭菌15min。

1.3　培养方法1.3.1　产孢斜面

从4 ℃冰箱中取出保藏菌种，接种环挑取少量孢子，接种于斜面，30 ℃培养6～7d。

1.3.2基础培养

250mL三角瓶加入50mL种子培养基，根据孢子密度与吸光度曲线：y=0.553x+0.014(x：×107/mL)确定接种量，置于35 ℃、200r/min的摇床培养24h。

1.3.3发酵培养

250mL的三角锥形瓶，适当装液量和接种量，置于38 ℃、220r/min的摇床培养60h。

1.4　分析方法

水分含量测定：采用FD-720型红外水分测定仪(日本KETT公司)测定。

孢子数量的确定：采用血球计数板计数。

试样制备：发酵结束，加入250g/LNaOH溶液，将发酵液pH调至偏碱，再加入360g/L的H2SO4，将pH调至7附近，将富马酸转化为易溶于水的钠盐进行检测。离心后，倒出上层清液待测。

葡萄糖、富马酸、乙醇含量测定：采用Agilent1200型高效液相色谱仪，Bio-RadAminexHPX-87糖柱，以5mmol/LH2SO4为流动相，流速为0.6mL/min，柱温55 ℃，示差折光检测器，进样量10μL。

2结果与讨论

2.1　同步糖化发酵培养基的优化2.1.1　( NH 4) 2 SO 4用量的确定

氮源的浓度对微生物的菌体生长和产物产量都有较大的影响，对于米根霉为代表的丝状真菌而言，氮源限制造成的环境胁迫是积累有机酸的重要营养特征。以(NH4)2SO4作为唯一氮源，考察(NH4)2SO4用量(0.71、0.51、0.31和0.21g/L)对米根霉SSF产富马酸的影响，结果见表1。

表1(NH4)2SO4用量对米根霉SSF产富马酸的影响

Table1Effectsofammoniumsulfateonfumaricacid

productionbySSFusingRhizopus oryzae

g· L -1

由表1可知：氮源用量的变化对富马酸产量的影响较小，(NH4)2SO4质量浓度为0.71g/L时，富马酸产量最高(11.81g/L)。随着(NH4)2SO4浓度的逐渐减少，菌体对葡萄糖的利用率下降，(NH4)2SO4用量为0.21g/L时，剩余葡萄糖质量浓度高达22.19g/L，而富马酸的产量并未有明显下降，且乙醇产量呈下降趋势。这可能是由于C/N比的增加，导致菌体胞质内富马酸酶酶活的提高，使碳流更倾向于形成富马酸的途径[10]。从菌体生物量的表现来看，氮源的减少，菌体颗粒直径明显较小，氮源的减少限制了菌体生物量的生长。

2.1.2纤维素酶用量的确定

纤维素酶的高成本是阻碍纤维工业化的一个重要原因，因此，除了开发高效廉价的纤维素酶之外，优化纤维素酶的用量也是降低生产成本的有效途径之一。考察纤维素酶用量(20、25、30和35U)对米根霉SSF产富马酸的影响，结果如表2所示。

表2　纤维素酶用量对米根霉 SSF产富马酸的影响

由表2可知：随着纤维素酶用量的增加，富马酸产量较为稳定，没有出现大幅度的变化。增加纤维素酶的用量可以增加纤维素酶与纤维素的黏附几率，可有效地将纤维素转化为还原糖，然而在一定条件下，纤维素分子能与纤维素酶分子结合的位点数量有限，当这些结合位点全被纤维素酶分子占据后，再增加纤维素酶用量，达不到增加酶解作用，加快还原糖的释放；另一方面从经济角度考虑，酶用量也要尽可能少[11]。因此，确定纤维素酶最佳用量为20U。

2.1.3CaCO3用量的确定

微生物都有它们生长的最适pH范围，为了维持环境中pH，同时降低产物抑制作用，培养基中往往要加入一定量的中和剂[11]。微生物发酵产富马酸的研究中，CaCO3是最常用的中和剂[4,10,12-13]。使用CaCO3为中和剂作用温和，不会对细胞造成损伤，有利于菌体生长；但CaCO3一次性投加过量时会对菌体造成包埋现象，不利于菌体与培养基接触而影响发酵进程。因此，考察CaCO3加入量(10、20、30和40g/L)对米根霉SSF产富马酸的影响，结果如表3所示。

表3　 CaCO 3加入量对米根霉 SSF产富马酸的影响

由表3可知：当CaCO3添加量为10g/L时，富马酸产量较低，且CaCO3的加入量过少时，米根霉对葡萄糖的利用率下降，这说明较低的CaCO3浓度不足以维持发酵液在一个适宜的pH范围，同时CaCO3能够提供一定的CO2，以激活丙酮酸羧化酶，使碳流主要分布于产生富马酸的胞质途径。所以，当CaCO3加入量不足时，会影响碳流的分布[14]。由表3还可知，当CaCO3的添加量过高或过低时，乙醇的浓度都较高。综合考虑，确定CaCO3的最适添加量为30g/L。

2.1.4接种量的确定

接种量是由发酵时菌体生长繁殖的速度决定的，通常较大的接种量可以缩短生长周期，使产物合成提前，但如果接种量过大则可能使菌种生长过快，溶氧量不足，从而影响产物的合成[15]。考察接种量(5、10、15和20%(体积分数))对碳源的利用情况和SSF产富马酸的影响，结果见表4。

由表4可知：随着接种量的增加，发酵剩余葡萄糖逐渐减少，但是过高的接种量，并未带来高的富马酸积累，原因可能是接种量提高，菌球数目增多，有氧呼吸较强，葡萄糖经糖酵解生成的丙酮酸大量进入三羧酸循环(TCA循环)被消耗，最终进入胞质转化为富马酸的量也较低[13]。而高接种量下乙醇的产量也较高，说明在一定阶段，高接种量会加速无氧呼吸。当接种量为5%时，富马酸产量低于接种量为10%时的产量，这是因为适当地增加接种量，有利于微生物快速进入到对数期，使整个发酵周期中的产酸期相对延长。因此，选定米根霉发酵产富马酸的最佳接种量为10%。

表4　接种量对米根霉 SSF产富马酸的影响

2.1.5装液量的确定

对好氧性真菌米根霉而言，溶氧对于其菌体生长和产物积累都有较大影响，溶氧越多，菌体生长越快，有氧呼吸越强，TCA循环产生的ATP越多，可以为丙酮酸羧化酶催化丙酮酸转化为草酰乙酸所用，同时TCA循环本身也是积累富马酸的次要途径[4-5]。因此，在一定范围内，高的溶氧可以带来高的富马酸积累[13]。锥形瓶中的装液量直接影响溶氧水平，从而影响根霉细胞生长和富马酸的积累。考察装液量(50、75、100和125mL)对米根霉SSF产富马酸的影响，结果如表5所示。

表5　装液量对米根霉 SSF产富马酸的影响

由表5可知，相同转速下，装液量越少，溶氧条件越好。随着装液量的升高，富马酸产量越来越低，而乙醇的积累则越来越高。这说明，装液量越低，米根霉的无氧呼吸越弱。由此可知，装液量是影响摇瓶发酵溶氧的重要因素。装液量越高，溶氧越少，无氧呼吸越强，进而促进了副产物乙醇的积累。因此，最佳装液量为50mL。

2.2　碱预处理玉米芯同步糖化发酵产富马酸

经过碱预处理的玉米芯渣，作为一种木质纤维原料，含有丰富的纤维素，可以作为SSF碳源进行米根霉同步糖化发酵产富马酸。碱预处理破坏了玉米芯的结构，使其结构松散，且去除了大量的半纤维素和木质素，这些都有利于纤维素降解成单糖的酶解过程[16]。而以玉米芯为唯一碳源的培养基中，除了大量的纤维素成分外，蛋白质、脂类等也为米根霉提供了生长所需的营养成分[17]。以碱预处理玉米芯渣为碳源的同步糖化发酵过程，与米根霉纯糖发酵产富马酸的对比，结果如图1所示。

图1　米根霉同步糖化发酵与纯糖发酵产富马酸的对比 Fig.1　 Comparison of production of fumaric acid between SSF of alkali-pretreated corncob and direct fermentation of glucose

由图1可知：以碱预处理玉米芯渣为碳源的发酵，前期积累的葡萄糖较多，当米根霉菌体小球生长完全并开始产酸时，葡萄糖的含量急剧下降。而以葡萄糖为碳源时，菌体可直接利用培养基中的碳源进行生长和产酸，36h时，葡萄糖已经完全耗尽。米根霉是非生长耦联型的产酸机制，因此富马酸的分泌均在菌体生长完全以后，且SSF过程中乙酸-乙酸钠缓冲液的存在，延迟了菌体的生长，但适宜浓度的乙酸会促进乙酰辅酶的生成，有利于细胞的代谢[18]。对于SSF发酵60h后，葡萄糖完全耗尽，富马酸的产量达到最高13.78g/L，而葡萄糖发酵富马酸的产量最高仅6.21g/L。且葡萄糖发酵后期，菌体死亡导致发酵液pH的明显上升。

根霉利用木质纤维原料同步糖化发酵产富马酸的研究较少，李硕[19]以小麦麸皮为碳源，利用戴尔根霉同步糖化发酵产富马酸，底物添加量为100g/L，而富马酸产量仅为6.06g/L。本研究虽然只是在低底物浓度的条件下进行了同步糖化发酵的试验，但是为米根霉利用木质纤维原料同步糖化发酵产富马酸的发展奠定了一定的前期基础。

3结论

米根霉利用碱预处理玉米芯渣SSF发酵产富马酸的培养基优化结果：50g/L碱预处理玉米芯渣，(NH4)2SO4质量浓度0.71g/L，纤维素酶用量20U(以1g纤维素计)，CaCO3加入量30g/L，接种量10%(体积分数)，装液量50mL。

米根霉利用碱预处理玉米芯渣SSF与纯糖发酵产富马酸对比表明，在SSF过程中富马酸产量最高可达13.78g/L，纯糖发酵的富马酸产量仅6.21g/L。

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