反相离子对色谱法对寡核苷酸药物分析的进展

杨洪淼，范慧红

(中国食品药品检定研究院，北京 100050)



反相离子对色谱法对寡核苷酸药物分析的进展

杨洪淼，范慧红Δ

(中国食品药品检定研究院，北京 100050)

寡核苷酸药物是近年来药物研发领域中的热点之一，相应分析方法的研究也被广泛开展，其中反相离子对色谱法以分离度高、易与MS对接等优势成为寡核苷酸分析中最常用的方法。本文综述了反相离子对色谱法在寡核苷酸分析方面的新进展，以下将从色谱柱、流动相，分离规律的探索，MS检测器方面进行系统介绍。

离子对试剂；高效液相色谱；寡核苷酸药物；综述

寡核苷酸药物是指含有10～30个碱基的RNA或DNA分子，及其类似物，可以在基因水平上干扰致病蛋白质的产生，从而达到治疗疾病的目的。目前药物研发的方向根据作用机理主要分为：反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide ,asON)，是指含有15～30个碱基的核酸分子或其类似物，能与特定的DNA、RNA以碱基互补配对的方式结合并阻止其转录与翻译，这是一类经典的寡核苷酸药物，通常会进行结构修饰以增加对体内核酸酶的稳定性，最常见的修饰为将磷酸二酯键中的一个非桥氧原子用硫原子取代，被称为硫代寡核苷酸[1]；另一类是小分子干扰RNA(small-interfering RNAs，siRNAs)，通常为含有21～23 个碱基的单链或双链RNA，可以引发RNA 干扰现象，即指由于目标mRNA降解或翻译抑制所引起的转录后基因沉默现象[2]；此外也有核酸适配体[3]等研究方向。至今FDA已批准了数个寡核苷酸药物的上市，如2013年获批上市的米泊美生(mipomersen)，而处于临床研发阶段的药物数量更多。由此可见，开展对寡核苷酸分析方法的研究工作非常必要。

寡核苷酸药物的分子量较大，通常为6000～8000，同时在水中几乎以阴离子形式存在，会形成一个负电荷聚集的分子体[4]。根据这样的结构特征，常用的分析方法有反相离子对色谱、亲水色谱、离子交换色谱、毛细管电泳和PCR等方法[5-8]。其中反相离子对色谱以分离度高、结果稳定、操作简便和易与MS检测器对接等优势，在近年的文献中越来越多被使用到。本文通过列举一些寡核苷酸药物分析方法开发的实例，和对寡核苷酸类物质分析方法研究的新进展等内容的介绍，希望对今后这一类新型药物分析方法的开发提供参考。

1 色谱柱

使用离子对色谱方法对寡核苷酸进行分析时，最常用的色谱柱即C18柱。 Fountain等[9]使用小粒径的C18柱(4.6 mm×75 mm，2.5 μm)可同时将5～30个碱基的寡核苷酸实现N与N-1序列的分离。Studzińska等[10]考察了6根UPLC色谱柱对含有细微差别的多个寡核苷酸的分离效果，以C18柱和苯基柱为最优，并同时考察了离子对试剂的种类和浓度对分离的影响。小粒径色谱柱可以缩短寡核苷酸分子在固定相内扩散的路径，从而抑制峰形展宽，更有利于分离。此外采用高分子骨架的色谱柱可以对偏碱性的流动相及较高的柱温条件更加耐受。

近年来一些新型的色谱柱也被用于寡核苷酸的分析中。Sharma等[11]，Xiong等[12]尝试采用聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物为固定相的整体柱(monolithic column)可以将修饰基团连接到不同碱基位点的寡核苷酸同分异构体进行成功分离。Biba等[13]，Zimmermann等[14]使用一种结合离子交换与反相2种分离模式的色谱柱对20个碱基左右的寡核苷酸进行分析，分离过程同时利用了寡核苷酸的负电性和疏水性。文献中发现若使用离子对试剂作为流动相，分离仍以反相模式为主导；若使用离子交换色谱的条件，如NaCl溶液梯度洗脱，所得色谱图与只使用离子交换色谱柱的结果差异非常大，说明此时分离过程为混合模式，并且使用NaCl或NaBr作为流动相可以显著改善寡核苷酸的峰形。Studzińska等[15]在实验室制备中作为新型固定相将硅胶基质上同时键合1个疏水基团和1个亲水基团，根据疏水基团的不同分为酰胺型和胆固醇型，此种类型固定相首次应用于寡核苷酸的色谱分析中，结果表明它们的分离效果与C18柱相当，但分离时间会更短。

2 流动相

由于寡核苷酸具有强烈的负电性，在常规的反相色谱条件下保留较弱，所以需要在流动相中添加离子对试剂。强离子对试剂如季铵盐会使寡核苷酸产生强保留，但同时会削弱不同碱基疏水性差异对保留的影响，反而不利于寡核苷酸药物与杂质的分离[16]。而三乙胺(triethylamine，TEA)体系为较弱的阳离子对体系，在寡核苷酸分析中最为常用。三乙胺/醋酸(triethylamine/acetic acid，TEAA)系统是最先被应用的，通常30个碱基以内未修饰的寡核苷酸均可以达到N与N-1序列的分离[17]。但硫代寡核苷酸由于硫原子取代了氧原子，使得每一个磷原子形成为一个手性中心，理论上N个碱基长度的硫代寡核苷酸可以形成2n-1个非对映异构体，这些异构体在色谱保留行为上的细小差异最终造成严重的峰形展宽[4]。Apffel等[18]开创性地引入六氟异丙醇(HFIP)至离子对系统中，该试剂可以有效地抑制硫代寡核苷酸的峰形展宽，从而提高分离度。因为流动相中HFIP会显著降低TEA在水中的溶解度，所以推测HFIP会迫使TEA更多地贴合在硅胶柱的表面，使硅胶表面形成一层稳定的TEA+膜，此时的分离模式更倾向于离子交换，从而抑制对映异构体由于疏水性差异造成的峰形展宽[4]。

Cantide、CT102和流感泰得[19-21]均为研发中的硫代反义寡核苷酸药物，分别为20、20和13个碱基长度。它们均可以应用C18柱、离子对试剂TEA/HFIP的方法使主成分与杂质达到良好地分离。硫代寡核苷酸的合成杂质主要由短序列和硫代失败序列构成，其中以5’N-1序列和一个氧未被硫代(P=S/O)的N序列最多，由于杂质与主成分结构极为相似，分离难度很大。之前通常采用阴离子交换色谱法分析P=S/O杂质及其他杂质，但离子交换色谱对N-1杂质无能为力，需再采用毛细管电泳方法分析N-1杂质。而反相离子对色谱法的优势是可以同时分离N-1杂质和P=S/O杂质，简化了分析步骤。根据文献中优化的结果，通常TEA与HFIP的浓度范围分别为10～40 mmol/L和100～400 mmol/L的时候，更利于20个碱基长度左右的硫代寡核苷酸与杂质的分离。但不同序列的硫代寡核苷酸适用的TEA/HFIP的比例各不相同，需要通过实验优化。此外由于HFIP在乙腈中的溶解度很小，所以流动相中一般使用甲醇作为有机相。

除此之外，N，N-二甲基丁胺/醋酸(DMBAA)、四乙基溴化铵/醋酸(TEAB)、醋酸正己基铵(HAA)等离子对系统也被应用于寡核苷酸的反相色谱分析中[10,22-23]。Studzińska等[10]比较了DMBAA与TEAA对未修饰寡核苷酸分析的差别，结果显示DMBAA虽增加保留时间但会降低分离度。Levin等[24]尝试开发多种离子对试剂联合应用于siRNA的分析，结果显示TEA/丙胺(PA)的组合可使整体分离度提高，并可明显改善峰形。

3 分离规律的探索

3.1 保留时间的预测 由于组成寡核苷酸的核苷的疏水性各不相同，A和T的疏水性要大于C和G，所以长度或序列不相同的寡核苷酸在反相色谱中的保留时间也不同。Gilar等[25]建立的数学模型可以预测10～60个碱基内不同长度与序列的寡核苷酸的保留行为，采用的色谱条件为100 mmol/L TEAA离子对试剂，pH为7。并进一步设计39个寡核苷酸对此模型进行验证，结果显示预测值与实测值的相关性很好，r2为0.946。此研究可用于合成寡核苷酸的纯化中，通过该数学模型即可得到最佳的梯度洗脱的初始有机相比例，节省优化色谱条件的时间。在此基础上，Sturm等[26]也建立了对寡核苷酸保留时间的预测模型，并且有2个进步，一是使用支持向量回归(SVR)的方法代替单一的线性回归或对数回归，SVR可以模拟非线性关系；二是将寡核苷酸二级结构的信息引入模型中，从而提高预测的准确性。Lei等[27]建立的定量结构-保留时间关系(QSRR)模型可以将寡核苷酸的结构信息进行量化的输入，并且可以很好地预测多个柱温下的保留时间。而Studzińska等[28]进一步将QSRR模型成功应用于寡核苷酸在酰胺柱和胆固醇柱上的保留行为的预测。

3.2 流速与柱温对分离的影响 由于寡核苷酸的传质速率较低，根据Van Deemter方程，影响塔板高度最主要的参数项为传质阻抗项，所以影响传质速度的因素都将显著影响寡核苷酸的分离。基于此理论，降低流速和提高柱温被认为是提高寡核苷酸分离度的有效手段，如流速0.5 mL/min和柱温50 ℃为常见色谱条件。骆雪芳等[29-30]对此进行了深入的研究，设计19、20、21个碱基的不同长度的3条寡核苷酸链，和相同长度(20个碱基)但序列上有细微差异的3条寡核苷酸链。通过实验考察流速和柱温的变化对分离度的影响。结果显示，对于碱基数目较大、以长度差异为主要特征的寡核苷酸序列，增加温度是改善分离的有效途径。而对于同长序列，提高温度的影响各不相同，由于疏水性强的碱基处于末端对保留贡献大，若处于中间位置则取决于其在空间结构中的位置，所以疏水碱基处于末端等优势位置时，随温度的改变保留影响不大，处于中间等劣势位置容易受到温度的影响，产生较大的保留改变。对于流速的影响，所有寡核苷酸链随流速增加，保留均迅速下降，分离度也呈下降趋势，但基于长度差异的样品的分离度下降得更明显，此类样品应注重流速的优化，但过低的流速会使样品纵向扩散增加，同样发生分离度下降情况。

4 MS检测器

反相离子对色谱(IP-HPLC)通过添加挥发性的离子对试剂可以与质谱更好地对接，而质谱由于其高灵敏度和快速定性等特性成为寡核苷酸药物分析中的重要分析手段。

反相离子对色谱与ESI-MS联用在药物代谢研究中发挥着重要作用[31-33]。Wei等[31]采用IP-HPLC-MS/MS的方法对硫代寡核苷酸药物GTI-2040的药代产物进行鉴定。IP-HPLC的条件可以得到N与N-1序列的分离，高分离度是药代产物鉴定的前提。文中使用SOS寡核苷酸序列分析软件(the simple oligonucleotide sequencer software)，共鉴别了5种代谢产物。Dai等[32]也采用上述IP-HPLC-MS/MS的方法对硫代寡核苷酸药物G3139的药代产物进行鉴定，并建立了G3139和3个代谢产物的定量分析方法，最小定量限(LOQ)为17.6 nmol/mL。

使用MS/MS对短链的寡核苷酸进行测序已是较为成熟的方法[34]，但经过化学修饰的寡核苷酸，裂解行为发生改变，测序工作则更具挑战。Kretschmer等[35]采用IP-HPLC-MS/MS的方法对化学修饰的siRNA进行测序，待测物包含2’-O-甲基化和硫代2种修饰方式，该方法的建立可以很好地对寡核苷酸合成的过程进行实时监测。

HFIP可以显著提高寡核苷酸的离子化效率，提高质谱检测的灵敏度。近年来对适用于质谱的离子对试剂的研究也很多[36-39]。McGinnis等[36]发现小于100 mmol/L的HFIP对质谱的信号增强作用更明显，比较了13种烷基胺分别与HFIP组成离子对试剂对质谱信号的增强作用，得出待测物寡核苷酸的疏水性与离子对试剂的选择关系很大，10 mmol/L二异丙胺(DIPA)和25 mmol/L HFIP适用于大部分亲水性的siRNA，15 mmol/L三丙胺(TPA)和50 mmol/L HFIP适用于中等疏水性的未修饰DNA片段，10 mmol/L二异丙基乙胺(DIEA)和50 mmol/L HFIP适用于疏水性更强的硫代寡核苷酸。

此外也有多篇文献是与ICP-MS联用或与MALDI-TOF-MS联用的应用实例[40-42]。Vallone等[40]采用IP-HPLC的方法将短链DNA进行分离和收集，后采用MALDI-TOF-MS进行鉴定，液相步骤中所采用的离子对试剂为TEAA。Studzińska等[42]通过IP-HPLC与ICP-MS联用的方式建立了血浆中硫代寡核酸的含量测定方法，并进行了方法学验证。离子对试剂采用TEA/HFIP，但发现高浓度的HFIP会产生较高的背景干扰。

5 展望

综上所述，反相离子对色谱法是寡核苷酸分析的一种非常有效的手段，今后的研究方向一方面为更多新型的固定相被应用，如兼具反相与离子交换模式的固定相，以及更多的离子对试剂被开发，尤其是可以提高MS检测灵敏度的离子对试剂；另一方面反相离子对色谱法分析寡核苷酸的分离机理及分析规律也将更多地被揭示。

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(编校：王俨俨)

Progress of ion-pairing reverse liquid chromatography for analysis of oligonucleotides

YANG Hong-miao, FAN Hui-hongΔ

(National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050)

Therapeutic oligonucleotides have been one of the hottest areas in R&D of drugs in recent years.The research of analysis method has been widely carried out.Ion-pairing reverse liquid chromatography is the most commonly used method for good resolution and easy docking with MS.A review is presented here on the progress of oligonucleotides analysis with ion-pairing reverse liquid chromatography.The column, mobile phase, MS detection, mechanism of analysis will be discussed.

ion-pairing agents; HPLC; therapeutic oligonucleotides; review

杨洪淼，女，硕士，助理研究员，研究方向：生化药品的质量分析和质量标准的研究，E-mail：yanghongmiao@163.com；范慧红，通讯作者，女，博士，研究员，研究方向：生化药品的质量控制和质量标准的研究，E-mail：shenghuayaoshi@126.com。

R917

A

1005-1678(2015)07-0161-04