银杏叶分散片中总黄酮醇苷的含量测定

银杏叶分散片中总黄酮醇苷的含量测定

齐惠珍周霞瑾田培虹

项目来源：河北省医学科学研究重点课题(编号:20100419)

【摘要】目的建立HPLC法测定银杏叶分散片中总黄酮醇苷含量的方法。方法色谱柱为Waters-pak C18 (5 μm，3.9 mm×150 mm)，流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)，检测波长360 nm，流速1.0 ml/min。结果异鼠李素、槲皮素、山奈素呈良好线性关系的范围分别为 0.001～0.01 mg、 0.02～0.2、0.004～0.04/ml,平均回收率分别为99.76%，100.15%,99.40%，RSD为0.37%、0.72%、0.66%(n=9)。结论本方法准确性好，专属性强，灵敏度高，结果可靠，可用于银杏叶分散片中总黄酮醇苷的含量测定。

【关键词】高效液相色谱法；银杏叶分散片；总黄酮醇苷

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.20.050

【中图分类号】R 927.2

收稿日期：(2015-05-09)

银杏叶分散片是银杏叶片剂型的一种，也是目前市场应用比较普遍的银杏叶剂型，其主要活性成分为总黄酮醇苷和萜类内酯。总黄酮醇苷中槲皮素、山奈素、异鼠李素三种黄酮苷元为其主要化学成分。作用于心脏、脑血管及外周血管系统，对治疗冠心病、心绞痛、高血压、支气管哮喘等病症有显著效果[1]。本文参考《中华人民共和国药典》(2010版)[2]及南葶苈子饮片中异鼠李素、槲皮素等成分的含量测定方法及相关文献资料[3,4]，采用高效液相色谱法对银杏叶分散片中总黄酮醇苷的含量进行测定。

1材料与方法

1.1仪器与试剂主要实验仪器：2487紫外检测器、美国生产Waters高效液相色谱仪、515液相色谱泵。采用市场销售的银杏叶分散片制剂三种，A：北京某制药有限公司，国药准字Z20055421，批号131105 B：吉林某药业有限公司，国药准字Z20060440，批号 141009；C:吉林某药业有限公司，国药准字Z20060440，批号140304。异鼠李素(批号110860-200205，中国药品生物制品检定所)；槲皮素(批号10081-200406，中国药品生物制品检定所)；山奈素(批号110861-200303，中国药品生物制品检定所)；水采用的是二次纯化水，甲醇采用色谱纯、磷酸为分析纯等试剂。

1.2色谱条件色谱柱：Waters Nova-pak C18 (5 μm，3.9 mm×150 mm)，流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)，流速1.0 ml/min，检测波常长为：360 nm。

1.3溶液的制备

1.3.1制备供试品溶液:随机选取20片银杏叶分散片，研细，取相当于总黄酮醇苷19.2 mg的粉末，精密称定，置100 ml容量瓶中，加甲醇-25%盐酸溶液(4∶1)的混合溶液25 ml，置水浴中加热回流30 min，使其充分溶解，待溶液冷却降至室温后，向上述100 ml量瓶中加甲醇稀释至刻度，震荡摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜过滤后所得滤液，即为银杏叶分散片供试品试液。

1.3.2制备对照品溶液:精密称取适量的异鼠李素、槲皮素、山奈素对照品，分别加入甲醇溶液制备成异鼠李素、槲皮素、山奈素的混合对照品溶液，浓度分别为0.01 mg/ml、0.20 mg/ml、0.04 mg/ml。

2方法与结果

2.1线性关系考察量取“1.3.2”项下异鼠李素、槲皮素、山奈素的对照品与甲醇溶液配制成如下浓度的混合溶液：对照品溶液1(含异鼠李素0.001 mg/ml、槲皮素 0.02 mg/ml、山奈素 0.004 mg/ml)，对照品溶液 2(含异鼠李素 0.002 mg/ml、槲皮素 0.04 mg/ml、山奈素0.008 mg/ml)，对照品溶液 3(含异鼠李素 0.004 mg/ml、槲皮素 0.08 mg/ml、山奈素 0.016 mg/ml)，对照品溶液 4(含异鼠李素 0.008 mg/ml、槲皮素 0.16 mg/ml、山奈素 0.032 mg/ml)，对照品溶液 5(含异鼠李素 0.01 mg/ml、槲皮素 0.20 mg/ml、山奈素 0.04 mg/ml)。 精密吸取并向液相色谱仪中分别注入对照品溶液20 μl，记录峰面积， 以峰面积 A对进样量 C进行线性回归，分别得到异鼠李素、槲皮素、山奈素的线性回归方程：异鼠李素 A=24 179 214C-225 761(r=0.9997)；槲皮素 A=31 247 671C-15 557(r=0.9996)；山奈素 A=30 420 567C + 614 691 (r=0.9998)。 实验结果表明，异鼠李素、槲皮素、山奈素分别在0.001～0.01、0.02～0.2、0.004～0.04 mg/ml 浓度范围内具有较好的线性关系。见图1。

采用陈杭君等[10]的方法，略有修改，具体操作如下。取2 g样品，加入5 g水，加入20 mL 70% pH 3.0的酸性乙醇溶液，在40 ℃下水浴2 h，提取至提取液无色，过滤后备用。采用pH差示法测其花色苷的含量，取2 mL提取液于25 mL比色管中，用pH 1.0缓冲液（0.2 mol/L KCl-0.2 mol/L HCl）稀释至10 mL刻度线处，另取2 mL提取液于25 mL比色管中，用pH 4.5缓冲液（1 mol/L NaAC-1 mol/L HCl-H2O）稀释至10 mL刻度线处，在510 nm处测量吸光度值。根据下式计算总花色苷含量（g/L）。

图1　HPLC色谱图(I=异鼠李素，Q=槲皮素，K=山奈素)

(1)混合标准品色谱图; (2)分散片样品色谱图

2.2精密度试验精密吸取10 μl对照品混合溶液，按“1.2”项下所列的色谱条件，重复进样5次，并分别记录每次所得的峰面积。测得异鼠李素峰面积的RSD为1.6%、槲皮素峰面积的RSD为1.5%、山奈素峰面积的RSD为1.3%，表明具有较好的精密度。

2.3稳定性试验取银杏叶分散片(批号140304)供试品溶液，按“1.2”项下所述的色谱条件，于(0、1、2、4、8、12、24 h)分别进样10 μl，记录各时间点的峰面积，结果异鼠李素峰面积RSD为1.2%、槲皮素峰面积RSD为1.0%、山奈素的峰面积RSD为0.8%，结果表明，在室温条件下，供试品溶液在24 h内稳定。

2.4重复性试验取相同批号的银杏叶分散片(批号140304)各6份，按“1.3.1”项下方法制备所需供试品溶液，进样量为10 μl，分别测得峰面积，再按照公式，总黄酮醇苷含量=(异鼠李素含量+槲皮素含量+山奈素含量)×2.51计算，得出异鼠李素、槲皮素、山奈素的含量分别为0.68、4.45、2.85 mg/粒，总黄酮醇苷平均含量为20.03 mg/粒(RSD=1.5%)。结果表明，本法具有较好的重复性。

2.5加样回收率试验精密称取相同批号的银杏叶分散片(批号140304)适量，分别精密加入对照品，按照供试品溶液制备项所述的操作进行测定。测得槲皮素、山奈素、异鼠李素的平均回收率分别为99.76%、100.15%和99.40%，RSD分别为0.37%、0.72%、0.66%。见表1。

2.6样品含量测定取3个生产批号的银杏叶分散片，按“1.3.1”项所述方法，分别制成10 μl的银杏叶分散片供试品溶液及“1.3.2”项下的混合对照品溶液，注入色谱仪，按“1.2”项下所列的色谱条件依次测定，并记录每次的峰面积。按色谱外标法计算出样品中异鼠李素、槲皮素、山奈素的含量，从而得到总黄酮醇苷的含量。见表2。

3讨论

3.1检测波长的选择在实验过程中，分别采用340 nm、360 nm、380 nm波长进行测试，其中360 nm

表1　回收率试验结果　n=9

表2　样品含量测定结果　n=3，%

有最大吸收峰，因此，采用360 nm为检测波长。

3.2流动相的选择:为了使所检测的色谱峰分离度好，出峰时间合理，本实验经查阅文献后[5,6]，分别试用甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)及甲醇-水(50∶50)，乙腈-0.4%磷酸溶液作为流动相进行考察。当流动相甲醇-0.4%磷酸溶液配比为(50∶50)时，可以实现主要成分与杂质完全分离的目的，得到分离效果较好的色谱峰。而甲醇-水和乙腈-0.4%磷酸溶液对峰形及分离度影响不大，故选择甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)作流动相系统。

3.3在提取时，通过对甲醇超声提取、甲醇-25%盐酸溶液(4∶1)的混合溶液水浴加热回流法、盐酸加热水解法这三种不同的提取方法进行对比分析，试验结果表明，甲醇-25%盐酸溶液(4∶1)的混合溶液水浴加热回流法，可使黄酮醇苷类成分较完全的水解，提取效果较好。

3.4考察了甲醇-10%盐酸溶液、甲醇-25%盐酸溶液、甲醇-30%盐酸溶液等不同酸强度、不同温度下及不同冷却时间(10 min、20 min、30 min)对测定结果的影响。结果甲醇-25%盐酸，水解温度为95℃，可使黄酮醇苷完全水解，速冷30 min可使反应停止。

本研究的实验方法，简便快捷，有较好的稳定性，重现性好，可作为银杏叶分散片中测定总黄酮醇苷含量较为可靠的方法。

参考文献

1潘洪平.银杏叶制剂药理作用和临床应用研究进展.中国中药杂志, 2005, 30: 93.

2国家药典委员会主编.中华人民共和国药典.一部. 北京:化学工业出版社，2010.1079.

3沈洁,任世禾.复方银杏叶胶囊质量标准的研究.上海中医药杂志, 2007, 41: 79.

4马梅芳,吕文海.HPLC 法同时测定南葶苈子饮片中槲皮素、山奈素及异鼠李素的含量.中国药事,2009,23:65-67.

5姜帆，杨星刚，郭迎新,等. 银杏叶制剂溶出度中槲皮素、山奈素与异鼠李素的HPLC测定方法研究. 沈阳药科大学学报,2013,30:691-695.

6齐惠珍，周霞瑾，王明霞. 3种不同剂型银杏叶制剂中总黄酮醇苷的溶出度考察.华西药学杂志，2014,29：630-632.

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