高压氧疗法对大鼠心理应激条件下的牙周炎治疗效果观察

高压氧疗法对大鼠心理应激条件下的牙周炎治疗效果观察*

王瑢▲，桃子玺▲，何梁伟，黄世光△

(暨南大学医学院口腔医学系，广东 广州 510632)

[摘要]目的： 探讨心理应激对大鼠实验性牙周炎的影响，观察高压氧(hyperbaric oxygen, HBO)治疗对心理应激相关牙周炎的疗效。方法：清洁级4周龄雄性Wistar大鼠80只，随机分为4组：(1)正常对照组；(2)牙周炎组：用浸有牙龈卟啉单胞菌株的丝线结扎左侧上颌第2磨牙牙颈部，复制实验性牙周炎模型；(3)单纯应激组；(4)牙周炎+应激组。于实验后第9周停止应激刺激，对除正常对照组外其它各组大鼠每组选取4只进行HBO治疗。于实验后2、4和8周末分批处死动物，每组处死4只，于实验后10周末处死动物，每组处死8只。采血检测血糖浓度、血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质类固醇和肾上腺素含量。测量术区的牙周附着情况，制作牙体牙周联合切片，观察牙周的组织学改变。结果：检测应激标记物的变化可见单纯应激组的血糖及血浆ACTH、皮质类固醇和肾上腺素含量在实验后第2、4周明显高于正常对照组和牙周炎组(P<0.01)，第8周时血糖降至正常水平，但血浆ACTH、皮质类固醇和肾上腺素含量仍高于正常对照组和牙周炎组(P<0.05)；牙周炎+应激组在实验后第2、4和8周血糖及血浆ACTH、皮质类固醇和肾上腺素含量均高于正常对照组和牙周炎组(P<0.05)；HBO治疗组牙周炎+应激组血糖明显低于非治疗组(P<0.01)，单纯应激组和牙周炎+应激组血浆ACTH、皮质类固醇和肾上腺素水平显著下降(P<0.01)。大体观察可见正常对照组及单纯应激组牙周附着位置正常；牙周炎组出现牙龈萎缩，附着丧失明显；牙周炎+应激组附着丧失明显，根分叉暴露，HBO治疗后，牙龈水肿减轻，牙周袋变浅。单纯应激组与正常对照组在各时点的牙周附着水平的差异不显著(P>0.05)；牙周炎+应激组附着丧失程度在各时点均明显高于牙周炎组(P<0.01)；HBO治疗结束后牙周炎组及牙周炎+应激组牙周附着丧失程度减轻(P<0.01)。组织学观察可见牙周炎+应激组牙周组织破坏程度在各时点均重于牙周炎组；经HBO治疗后，牙周组织炎症程度减轻，炎症细胞浸润减少。结论：心理应激可加重牙周炎进程。HBO对大鼠实验性牙周炎及心理应激相关牙周炎均有治疗效果。

[关键词]牙周炎； 动物模型； 心理应激； 高压氧

[中图分类号]R781.4+2; R363[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.026

[文章编号]1000-4718(2015)11-2090-06

[收稿日期]2015-04-21[修回日期] 2015-09-14

[基金项目]*河南省教育厅2014年度科学技术研究重点项目 (No. 14B310006)

通讯作者△Tel： 0370-3251628; E-mail： sqyzmcx@163.com

Effect of hyperbaric oxygen on periodontitis with psychological stress in ratsWANG Rong, TAO Zi-xi, HE Liang-wei, HUANG Shi-guang

(FacultyofDentistry,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:thshg@126.com)

ABSTRACT[]AIM: To investigate the role of chronic psychological stress on periodontitis and the effects of hyperbaric oxygen (HBO) on periodontitis with psychological stress in rats. METHODS: Male special pathogen-free Wistar rats (n=80) were randomly divided into 4 groups: (1)normal control group; (2)experimental periodontitis group: the periodontitis model was induced by wrapping 3/0 silk ligature inoculated with Porphyromonas gingivalis around the left maxillary second molar of the rats; (3)psychological stress stimulation group; (4)periodontitis model with stress stimulation group. Psychological stress was removed at the 9th week after ligature, and 4 rats from each experimental group were randomly chosen for HBO treatment. The rats were sacrificed at the 2nd， 4th， 8th and 10th weeks after ligature. The levels of blood glucose, adrenocorticotropic hormone (ACTH), corticosterone and adrenaline were measured as the stress markers. The histological changes of periodontal tissues were observed under microscope with HE staining. RESULTS: The levels of blood glucose, ACTH, corticosterone and adrenaline in psychological stress stimulation group and periodontitis with stress group were significantly higher than those in control group and experimental periodontitis group at the 2nd and 4th weeks after ligature (P<0.05). The levels of the stress markers were significantly lower than those in untreated groups in the 10th week after HBO (P<0.01). The sites of gingival attachment were normal in control group and psychological stress stimulation group. Periodontal pocket, and periodontal attachment loss (AL) were observed in experimental periodontitis group. The tissue damage was much heavier in periodontitis model with stress stimulation group as the furcation of tooth was exposed and the tissue damage was observed on both sides of the adjacent teeth. No significant difference of AL between psychological stress stimulation group and normal control group during the experiment was observed. The AL in periodontal model with stress stimulating group was significantly higher than that in experimental periodontitis group at the 2nd, 4th and 8th weeks (P<0.01). The level of AL was attenuated at the 10th week after HBO (P<0.01). No difference of histological change in periodontal tissues was observed between control group and psychological stress stimulation group. Severer inflammatory changes and alveolar bone destruction were observed in periodontitis with stress group than those in experimental periodontitis group. The levels of inflammation reduced at the 10th week after HBO. CONCLUSION: Stress stimulation is one of the inducing factors of periodontitis in rats, which aggravates periodontitis. HBO may represent a useful way in treating psychological stress periodontitis.

[KEY WORDS]Periodontitis; Animal models; Psychological stress; Hyperbaric oxygen

牙周炎是一种多因素疾病，是导致牙齿缺失的主要原因，其发病机制复杂。现代心身医学认为，心理应激与牙周健康状况密切相关，是牙周炎的重要危险因子[1]。由于牙周炎造成的牙列缺损、异味、疼痛、出血等问题使得牙周炎患者多伴有明显的心理压力[2]。高压氧(hyperbaric oxygen，HBO)是指在超过0.1 MPa(1 ATA)压力环境下吸入纯氧[3]。目前对HBO治疗心理应激相关牙周炎的研究尚未见报道，因此，本研究通过建立大鼠牙周炎模型，观察心理应激对牙周炎的影响及HBO疗法对心理应激相关牙周炎的治疗效果，探讨高压氧治疗牙周炎的可能机制。

材料和方法

1材料

SPF级Wistar大鼠购于广东省医学实验动物中心；牙龈卟啉单胞菌株 (P.gingivalis)由四川大学华西口腔生物实验室提供；拜安易血糖仪(BAYER3253型)和拜安易血糖检测试纸(葡萄糖氧化酶法3257型)购于拜耳医药保健有限公司；促肾上腺皮质激素 (adrenocorticotrophic hormone, ACTH) 放免试剂盒和皮质类固醇放免试剂盒购于DiaSorin；肾上腺素放免试剂盒购于Biosource。YLC0.5/1型婴儿高压氧舱由西安第七零一研究所提供。

2方法

2.1牙周致病菌结扎丝线制备将3/0无菌丝线置于含有P.gingivalis改良GAM培养基(1 mg/L维生素K1、5%脱纤维蛋白羊血)中，于厌氧培养箱(体积分数：80% N2，10% H2，10% CO2)37 ℃培养5 d。

2.2动物模型的建立选取80只SPF级4周龄雄性Wistar大鼠，购于广东省医学实验动物中心，在恒温(22 ℃)、光照周期12 h交替、无特殊致病菌的环境中饲养1周后进行实验。实验分组如下：将实验动物编号，按随机数字表法分成以下4组，每组20只大鼠：(1)正常对照组：牙周不做任何处理；(2)单纯应激组：牙周不做任何处理，于实验开始每日予以心理应激刺激；(3)牙周炎组：根据本研究室已经建立的方法[4]，采用戊巴比妥钠麻醉后用浸有P.gingivalis菌的3/0丝线结扎大鼠左侧上颌第二磨牙牙颈部，结扎丝线置于龈沟内，于近中颊处打结，建立牙周炎模型(图1)；(4)牙周炎+应激组：按上法复制牙周炎模型，同时于术后每日施以心理应激刺激。上述各组大鼠除了正常对照组外，于实验第9周开始停止应激刺激，牙周炎组、单纯应激组和牙周炎+应激组各随机选取4只作为治疗组大鼠进行HBO治疗，连续治疗2周。实验后2、4和8周分批处死实验动物，每时点每组处死4只大鼠，实验后10周每组处死8只大鼠。

Figure 1.An image of standard ligature showed wrapped silk．

图1浸有牙周致病菌的3/0丝线结扎大鼠上颌第二磨牙牙颈部

2.3应激方案采取2种应激刺激方案：(1)限制性应激：将大鼠置于空间局限的小铁笼中，每次限制其活动及饮食2 h(图2)；(2)冷水浸泡应激：将大鼠置于空间局限的小铁笼中，用冷水浸至大鼠锁骨以上位置，每次浸泡2 h(图3)。实验开始后，每天随机选择上述2种应激方案中的一种施于应激组大鼠，以模拟现实社会应激源的多样性和不可预料性。

Figure 2.Restraint stress: a rat was placed in a tiny cages for 2 h to limit the activities and diet.

图2限制性应激

Figure 3.Ice water stress: the rats were placed in a tiny cage with appropriate ice water to immerse the rat lower limbs for 2 h.

图3冰水混合物浸泡应激

2.4HBO治疗方案于实验第9周停止应激刺激。上述各组大鼠除正常对照组外，牙周炎组、单纯应激组和牙周炎+应激组各随机选取4只作为治疗组进行HBO治疗 (0.25 MPa，YLC0.5/1型婴儿高压氧舱)，每天1次，每次暴露60 min，连续治疗2周后于实验第10周时处死动物。

2.5大体观察及组织学观察采用10%中性甲醛溶液心脏灌注处死大鼠，选用自制牙周探针检测牙周附着丧失。牙周附着丧失为釉牙骨质界到牙周袋底的距离，测量部位为实验牙颊、腭侧近中、中央、远中共6个点，取平均值。取出上颌骨，由中线切开，10%甲醛溶液(pH 7.0)固定48 h以上；采用混合脱钙液进行脱钙；制成近远中向5 μm厚度的牙体牙周组织联合切片，HE染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察牙周组织学改变。

2.6应激标记物的检测大鼠处死前非麻醉状态下剪尾取尾静脉血，采用拜安易血糖仪及血糖试纸测定血糖浓度。2%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉后固定大鼠，心脏采血2 mL，室温下于肝素抗凝管静置1 h，-25 ℃冰箱内过夜，第2天4 000 r/min离心10 min后取血浆，放射免疫分析法测定ACTH、皮质类固醇和肾上腺素(具体方法按试剂盒说明书操作)。

3统计学处理

应用SPSS 13.0统计学软件进行分析处理，所有数据以均数±标准差(mean±SD)表示。多样本间的比较采用完全随机设计的单因素方差分析(one-way ANOVA)，各组方差齐性时，多个样本均数间的两两比较采用最小显著差异(least significant diffe-rence, LSD)法检验，若方差不齐时采用Tamhane’s T2法，两样本间的比较采用小样本t检验。以P<0.05为差异有统计意义。

结果

1应激标记物改变

血糖、血浆ACTH、皮质类固醇及肾上腺素的变化见表1～4。单纯应激组的血糖、ACTH、皮质类固醇及肾上腺素在第2、4周时明显高于正常对照组和牙周炎组(P<0.01)，在8周时单纯应激组血糖恢复正常水平，血浆ACTH、皮质类固醇及肾上腺素水平在8周时下降，但仍较正常对照组和牙周炎组要高(P<0.05)；牙周炎+应激组的血糖、血浆ACTH、皮质类固醇及肾上腺素水平在第2、4和8周时均高于正常对照组和牙周炎组(P<0.05)。经HBO治疗后，牙周炎+应激组血糖明显降低(P<0.01)，单纯应激组和牙周炎+应激组血浆ACTH、皮质类固醇和肾上腺素水平与非治疗组相比显著下降(P<0.01)。

2大体观察

正常对照组及单纯应激组牙周附着位置正常。牙周炎组第2 周时轻度牙龈萎缩，探及浅牙周袋，尚无明显附着丧失；第4周时出现牙龈萎缩，附着丧失明显；第8 周时附着丧失明显加重。牙周炎+应激组第2 周时探及牙周袋，有附着丧失；第4 周时附着丧失严重；第8 周时附着丧失明显加重，根分叉暴露，累及两侧邻牙。于第9 周开始停止应激刺激进行HBO治疗后，牙龈水肿减轻，探诊见牙周袋变浅,见图4。

表1　各实验组和对照组大鼠血糖水平变化

P: periodontitis; S: stress. ** P<0.01 vs stress group; ## P<0.01 vs P+S group; △△ P<0.01 vs untreated group.

P: periodontitis; S: stress. * P<0.05, ** P<0.01 vs stress group; ## P<0.01 vs P+S group; △ P<0.05 vs untreated group.

P: periodontitis; S: stress. * P<0.05, ** P<0.01 vs stress group; ## P<0.01 vs P+S group; △△ P<0.01 vs untreated group.

P: periodontitis; S: stress.*P<0.05,**P<0.01vsstress group;##P<0.01vsP+S group;△△P<0.01vsuntreated group.

3附着丧失

附着丧失(attachment loss，AL)测量结果见表5，单纯应激组在各时点与正常对照组比较差异均无统计学意义；牙周炎组和牙周炎+应激组的AL在各个时点明显高于正常对照组和单纯应激组(P<0.01)；在第4、8周时牙周炎+应激组的AL明显高于牙周炎组(P<0.01)；牙周炎组和牙周炎+应激组随时间延长AL明显加重(P<0.01)；HBO治疗后AL水平明显下降(P<0.01)。

Figure 4.Observation of periodontal tissues in general. A: control group, no inflammation was found in the periodontal tissues; B: stress group (8 weeks), no inflammation was found in the periodontal tissues; C, D, E: periodontitis group (2, 4 and 8 weeks), visible inflammation was present; F, G, H: periodontitis + stress group (2, 4 and 8 weeks), severe inflammation was present; I: after HBO (10 weeks), periodontal inflammation was reduced.

图4各实验组各时点的大体观察

表5　各组大鼠牙周附着丧失的变化

P: periodontitis; S: stress.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsperiodontitis group;▲▲P<0.01vs4 week after operation in the same group;△△P<0.01vsuntreated group.

4组织学改变

正常对照组的牙周组织未见明显炎症表现，附着位置未见异常。牙龈上皮结构完整，牙周膜纤维排列整齐，结缔组织内未见明显的炎症细胞浸润，固有牙槽骨形态结构完整；单纯应激组与正常对照组相比无明显区别。组织学观察见牙周组织结构正常，牙周膜纤维排列整齐，沟内上皮、结合上皮完整，牙槽骨未见吸收；牙周炎组的组织学观察见牙龈上皮溃疡，组织深部可见大量炎症细胞浸润，结合上皮向根方增殖，胶原纤维变性，血管扩张充血，牙槽骨表面破骨细胞活跃，见凹坑状骨吸收，牙槽嵴顶高度降低；牙周炎+应激组的组织学观察见牙周膜纤维排列紊乱，出现胶原疏松、变性，大量炎症细胞浸润，结合上皮向根方增殖，牙槽嵴顶被破坏，可见破骨细胞和骨吸收陷窝。HBO治疗后，大鼠牙周组织炎症减轻，牙周膜纤维排列整齐，结缔组织内炎症细胞浸润减少，牙周组织中血管开放的数目增多，见图5。

Figure 5.Histological changes of periodontal tissues. P: periodontitis; S: stress.

图5各组大鼠牙周组织的HE染色结果

讨论

牙周炎是一种以牙周支持组织破坏为主要表现的慢性感染性疾病，最终可导致牙齿脱落[5]。牙周炎的发病机制复杂，单纯的某个因素无法解释该病的严重性和复杂性。牙周致病菌是牙周病的始动因素，但一些能增加宿主易感性的因素是影响牙周病发生、发展和对治疗反应的重要因素，其中心理应激就是其中之一。心理应激是指对人体造成伤害的心理因素。调查发现我国大城市人群健康危险性压力发生率为44.54%，约75%的疾病发生与心理压力有关，如高血压、冠心病、牙周病等[6]。调查显示，由于牙周炎造成的牙列缺损、异味、疼痛、出血等问题，使得牙周炎患者多伴有明显的心理压力，可表现为人际关系敏感、失眠、焦虑、抑郁、甚至敌对等情绪反应[2]。有学者通过临床问卷调查，认为心理应激是牙周疾病的重要风险因素，与牙周炎的病变程度呈正相关[7-8]。一般认为，各种社会和心理因素以应激为中介可通过神经-内分泌-免疫系统之间的相互作用、相互影响，导致宿主免疫防御能力降低，增加机体对致病菌的易感性[9]；心理应激还可通过刺激交感-肾上腺髓质轴，引起血浆中肾上腺素和去甲肾上腺素浓度升高，参与调控机体对应激的急性反应；同时由心理应激介导的一系列的代谢和心血管代偿机制(如调节心律和外周血管阻力、抑制胰岛素分泌、刺激胰高血糖素的分泌等)，可导致外周微血管收缩，微循环血液流量减少，从而导致组织缺血[10-11]。同时，牙周致病菌多以厌氧菌为主，心理应激加重了局部的缺氧状态，有利于厌氧菌的生长繁殖。有学者选取肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺和皮质类固醇等应激相关标志物，观察体外环境下应激相关标志物对牙周致病菌的影响。结果表明，应激相关标志物可以促进牙周致病菌的生长，对牙周疾病可能有一定的影响[12]。低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)是细胞低氧适应与应答调节的关键因子，在缺氧诱导下表达增强。乳酸脱氢酶1(lactic dehydrogenase 1, LDH1)主要分布在有氧代谢为主的器官。组织缺氧时，LDH1表达减少。HIF-1α在组织局部的表达情况以及血清LDH1水平可作为评价组织缺氧情况的指标。本实验室前期研究显示：牙周炎+应激组HIF-1α平均阳性细胞率在实验各时点显著高于牙周炎组[13]；血清LDH1水平在各时点均明显低于正常对照组和牙周炎组[14]，认为心理应激可造成牙周组织氧代谢障碍，应激刺激可能通过降低牙周组织氧代谢水平加重大鼠牙周炎症程度。本实验通过选取Wistar大鼠建立牙周炎动物模型，并每天从限制性应激刺激或冷水浸泡应激刺激2种应急刺激方案中随机选取1种来模拟复杂多变的社会心理应激刺激，同时防止了大鼠对应激源的适应。在实验后第2、4、8周时，检测应激标记物如血糖、ACTH、皮质类固醇、肾上腺素在实验组均升高，表明大鼠内分泌系统对应激刺激发生反应，处于应激状态。且牙周炎组、牙周炎+心理应激组和单纯应激组各项检测指标明显高于正常对照组，其中牙周炎+心理应激组最高，差异显著。大体观察及组织学观察发现牙周炎+心理应激组的炎症水平和牙周支持组织破坏程度明显高于牙周炎组，而单纯的心理应激组并无明显的牙周组织破坏。实验结果表明：单纯的心理应激不会引起大鼠的牙周组织破坏，但心理应激可以加重伴有牙周炎症大鼠的牙周组织破坏程度。Peruzzo等[15]在家兔口内通过结扎诱导的方法建立牙周炎模型，发现慢性心理应激刺激明显加重了牙槽骨吸收，本实验结果与Peruzzo等[15]的结果一致。

HBO治疗牙周炎是近年来牙周疾病治疗的一种新方法，既可单独应用于牙周疾病的治疗，也可与龈上洁治术、龈下刮治术、翻瓣术等其它牙周治疗手段联合使用，均有一定的治疗效果。研究发现，HBO+龈上洁治/龈下刮治的治疗效果最佳，认为HBO疗法结合牙周基础治疗手段对牙周炎有协同治疗作用[16-17]。本研究自实验后第9周起对治疗组大鼠进行HBO治疗，连续治疗2周。HBO治疗结束后牙周炎+应激组血糖明显降低，单纯应激组和牙周炎+应激组血清ACTH水平与非治疗组相比显著下降；大体观察见牙龈无明显水肿，探诊见牙周袋变浅；组织学观察牙周组织炎症破坏减轻，炎症细胞减少，与多数学者的研究结果一致。研究结果表明，HBO疗法对心理应激相关牙周炎具有明显疗效。

综上所述，本实验通过建立大鼠牙周炎模型，并给予心理应激刺激，结果显示心理应激能加重牙周炎的破坏程度，是牙周炎的重要危险因素。HBO疗法能显著改善牙周病的炎症程度，其确切的机理仍有待进一步的研究。

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(责任编辑：林白霜， 罗森)

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