通莲汤对裸小鼠胃癌移植瘤生长及缺氧诱导因子-1α的影响

2016-01-09张艳丽,贾永森,秦丽娟等

吉林中医药 2015年8期

张艳丽1，贾永森2，秦丽娟3，孙瑞军3

(1.迁安燕山医院，河北迁安 064400；2.河北联合大学中医学院，河北唐山 063000；

3.河北联合大学基础医学院，河北唐山 063000)

摘要：目的探讨复方通莲汤对胃癌MGC803细胞荷瘤裸鼠的抑瘤作用及对缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达的影响,为该方临床应用提供实验依据。方法胃癌细胞株MGC803接种于裸鼠右前肢皮下。模型组灌胃生理盐水溶液10 mL/kg，阳性对照组灌胃消癌平片1.8 g(生药量)/kg的药液10 mL/kg, 复方通莲汤高、中、低剂量组分别灌胃1.5，0.75，0.375 g(生药量)/L的药液10 mL/kg，各组连续给药3周，再连续观察3周,6周后处死小鼠，分离瘤组织，计算抑瘤率，免疫组织化学法检测肿瘤组织HIF-1α表达。结果高剂量通莲汤显著抑瘤生长，瘤重(1.51±0.49) g，抑瘤率为(61.04±4.79)%，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；通莲汤可显著抑制HIF-1α表达，与模型组比较，阳性表达率χ2=4.286，P=0.038<0.05。结论通莲汤可抑制裸鼠人胃癌MGC803细胞移植瘤生长，其抑瘤机制与下调肿瘤细胞HIF-1α蛋白表达有关。

关键词：通莲汤；胃癌；MGC803细胞；荷瘤裸鼠；缺氧诱导因子-1α

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.08.025

中图分类号：R285.5文献标志码： A

文章编号：1003-5699(2015)08-0837-04

基金项目:河北省自然科学基金(H2013209053)。

作者简介:张艳丽(1980-)，女，医学硕士，主治医师，主要从事中医内科学研究。

收稿日期:(责任编辑：赵玉芝2014-10-08)

*通信作者:贾永森，电子信箱-jysen@163.com

Tonglian Decoction on tumor growth and HIF-1α expression of tumor tissue

from nude mice modeled with gastric cancer cells

ZHANG Yanli1,JIA Yongsen2,QIN Lijuan3,SUN Ruijun3

(1.Yanshan Hospital of Qian’an,Qian’an,064400,Hebei Province,China;

2.Traditional Chinese Medicine College,Hebei United University,Tangshan 063000,Hebei Province,China;

3.School of Basic Medicine,Hebei United University,Tangshan 063000,Hebei Province,China)

Abstract:ObjectiveThe purpose of the research is to observe inhibition of Tonglian Decoction (TD) on nude mice modeled with gastric cancer cells MGC-803 and on hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) expression in tumor tissue,to provide experimental basis for clinical application of TD.MethodsMGC-803 cells are inoculated subcutaneously in right forelimbs of all mice.Mice in model group are treated with saline solution 10 mL/kg orally.Mice in positive control group are treated with Xiaoaiping tablet,dosage of 10 mL/kg,1.8 g/kg (crude drug) of liquid.Mice in TD groups are subdivided as high (1.5 g/L),medium (0.75 g/L) and low (0.375 g/L) dose group of drug liquid,with dosage of 10 mL/kg.All mice take administration for 3 weeks and are observed for another 3 weeks continuously.Tumor volumes are measured for 6 weeks everyday from the beginning of MGC803 cells transplanted.All mice are killed for isolation of tumor tissue,inhibition ratio of tumor-weight measured.Finally,HIF-1α expression is examined with immunohistochemistry.ResultsTumor weight in TD high-dose group is (1.51±0.49) g,and the inhibition ratio is (61.04±4.79)%,which is significantly different from that in the model group (P<0.05);Positive rate of HIF-1α expression also decreased significantly,showing statistical difference from the model group (χ2=4.286,P=0.038<0.05).ConclusionTD inhibits tumor growth on nude mice modeled with MGC803,through downregulation of HIF-1α protein expression.

Keywords:Tonglian Decoction;gastric cancer;MGC803 cells;nude mice transplanted with tumor;HIF-1α

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤，虽然综合治疗使得胃癌5年生存率有所提高,但患者预后效果仍然较差[1]。研究表明[2]，血管生成与胃癌发生及发展有密切的关系,缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)过度表达是促使肿瘤细胞生成、增殖的重要因素之一[3]。HIF-1α作为新近发现的促血管生长因子,可为抗血管生成治疗提供新的作用机制研究。

中医药治疗胃癌具有优势,表现在个体化、多靶点控制肿瘤生长[4]。根据该病中医基本病机，在“通幽汤”(《脾胃论》)基础上，结合现代中药药理研究成果，自拟“通莲汤”以益气活血、解毒散结，获得国家发明专利[5]。体外实验研究表明,该方可显著抑制胃癌MGC803细胞增殖[6],其抑癌机制与下调NF-κB信号通路IKKβ和NF-κB蛋白有关[7]。本研究通过荷瘤裸鼠实验，进一步观察了通莲汤对胃癌瘤体的抑制作用以及对HIF-1α的影响，以丰富该方防治胃癌的分子机制。

1材料

4～5周龄裸鼠(BALBc nu/nu)，雌、雄各半，体质量18～22 g，购于中国食品药品检定研究院，合格证号:SCXK(京)2009-0017；裸鼠在层流架内饲养，恒温22～25 ℃、恒湿(55±5)%，所有食物和水均灭菌后使用。MGC803人胃癌细胞株，由中国医学科学院基础医学研究所细胞中心提供。通莲汤(生地黄、当归、升麻、槟榔、通关藤、半枝莲、白花蛇舌草等)，各单味药物均购于北京同仁堂唐山连锁药店有限公司，提取液含生药材1.5 g/mL。消癌平片，批号110706，南京圣和制药有限公司。鼠抗人HIF-1α抗体(28 b,Santa Cruz生物科技公司)，新生小牛血清(GIBCO公司)，DMEM培养基(GIBCO公司)，胰蛋白酶(GIBCO公司)；MTT(Amresco公司)，DMSO(Amresco公司)。1100型无菌超净台(FORMA公司)，NOVAPATH 450酶标光度计(Bio-Tek公司)，3336 CO2培养箱(FORMA公司)，TMD-2倒置式显微镜(NIKON公司)，3MK型低温高速离心机(SIGMA公司)，JJ-2型组织匀浆机(Waring公司)。

2方法

2.1方药配制各味中药以纱布过滤掉药物杂质，并加入30倍体积超纯水，浸泡30 min，100 ℃温浸6 h，4层医用纱布过滤，收集药液，入烧杯中浓缩至200 mL，冷却至室温，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min 2次，吸取药液上清，0.22 μm滤器滤过后，加热浓缩收膏，计算提取物浓度，以生理盐水(NS)配至10 mg/mL，1.5 mL离心管分装，-20 ℃保存备用。

2.2细胞培养以10%小牛血清DMEM培养液8 mL，接种MGC803细胞于Φ100 mm培养皿中,置于37 ℃，5%饱和湿度的CO2培养箱孵育。

2.3分组及给药裸小鼠50只，随机分为5组，每组10只,分别为模型对照组，阳性对照药(消癌平)组，通莲汤高、中、低剂量组。将MGC803细胞传代至对数生长期，消化离心，计数，以1×107/mL的浓度接种于裸鼠右前肢皮下。模型对照组灌胃NS10 mL/kg;阳性药组灌胃消癌平片水溶液(生药量)1.8 g/kg，通莲汤高、中、低剂量组(生药量，下同)分别灌胃1.5，0.75，0.375 g/L的药液(以NS配成)，消癌平、通莲汤给药量均为10 mL/kg。各组均连续给药3周，后续观察3周后，裸鼠脱臼处死。

2.4检测指标

2.4.1计算抑瘤率裸鼠处死后，取肿瘤组织皮下完整剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜,于电子天平上称取瘤重，计算抑瘤率[8]。抑瘤率=〔(模型组平均瘤重-处理组平均瘤重)/模型组平均瘤重〕×100%

2.4.2形态学观察取部分剥离的瘤组织以10%中性福尔马林固定，石蜡包埋、制成4 μm厚的切片、HE染色、光镜下观察瘤组织细胞形态[9]。

2.4.3免疫组化法测定HIF-1α用40 g/L甲醛固定瘤块,石蜡包埋、切片。免疫组织化学法步骤按说明书进行，所有切片均在同一光强度，同一放大倍数下进行图像分析，染色阳性物质呈棕黄色颗粒状，位于细胞核内，只要有明确阳性产物即作为阳性细胞。表达率测定:每例标本在400倍光镜下，随机计数20个视野，记录每个视野的阳性表达率(阳性细胞数/全视野细胞数)，取其均数作为每例样本阳性表达率的评定依据。所占比率为0～5%为阴性(-),5%～25%为弱阳性(+)，25%～50%为中度阳性(++)，50%以上为强阳性(+++)[10]。

2.5统计学方法采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，组间差别显著性检验采用单因素方差分析；以P<0.05为差异有统计学意义。

3结果

3.1各药抑瘤率模型组和通莲汤中、低剂量组裸鼠瘤体重量较大；消癌平组，通莲汤高剂量组瘤重较小。通莲汤高剂量组、消癌平组与模型组相比，有显著性差异(P<0.05),两者抑瘤率均达到60%以上；通莲汤高剂量组与消癌平组作用相当。如表1。

表1　各组瘤体平均瘤重及抑瘤率 ± s)

注：与模型组比较，#P<0.05

3.2皮下移植瘤组织形态学观察模型组瘤组织内瘤细胞核大畸形、核仁深染，腺体拥挤，血窦丰富；通莲汤高剂量组、消癌平组的肿瘤细胞呈圆形或椭圆形，淡染，核分裂少见，可见较多肿瘤细胞肿胀变性坏死；间质中的淋巴细胞及单核细胞数量较模型组明显升高。通莲汤中、低剂量组细胞多数深染，可见小片状坏死区，与模型组相似。如图1。

3.3皮下移植瘤组织中HIF-1α蛋白的表达模型组、通莲汤中、低剂量组瘤体HIF-1α阳性表达率无显著性差异；通莲汤高剂量组、消癌平组HIF-1α阳性表达率与模型组相比均有显著性差异(P<0.05)，其中，通莲汤高剂量组与模型组比较阳性表达率χ2=4.286，P=0.038<0.05，说明通莲汤高剂量组均有较好稳定下调HIF-1α表达的作用。如图2和表2。

表2　各组荷瘤裸鼠瘤体组织HIF-1α阳性表达

注：与模型组比较，#P<0.05

图1　皮下移植瘤组织形态学病理切片(×100)

图2　各组癌组织HIF-1α表达(×100)

4讨论

通莲汤是依据“金元四大家”之一李东垣所创“通幽汤”加味化裁而来[11]，专为胃癌气阴亏虚、瘀血内结而设。鉴于该复方组成药物均为天然中药材，实验中选择同为中药属性的乌骨藤有效提取物——消癌平作为阳性对照药，许多基础和临床研究表明，其对胃癌具有确切疗效[12-13]。

本研究采用源于临床患者的人胃癌MGC803细胞，裸鼠皮下移植成瘤，观察通莲汤的抗癌作用。抑瘤率结果提示，通莲汤高剂量组、消癌平组抑瘤明显，抑瘤率达到60%左右,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，通莲汤中、低剂量组抑瘤率维持在20%～40%，与模型组比较无统计学差异。结果表明，高剂量通莲汤抑瘤生长作用较显著。

组织形态学检测结果显示，通莲汤高剂量组、消癌平组与模型组相比，瘤体组织结构改变较明显，瘤组织内有大片坏死区，表明两药对瘤细胞生长有明显的抑制作用，与抑瘤率测定结果一致。

恶性肿瘤快速生长使肿瘤细胞处于缺氧微环境中，胞内高表达的HIF-1α是主要的氧调节亚基，可以调节肿瘤细胞适应低氧状态[14]，诱导多个相关基因表达[15-16]，促进肿瘤血管生成[17]，从而促进肿瘤的浸润和转移[18]。本研究通过免疫组化研究显示，高剂量的通莲汤、对照药消癌平可显著抑制癌组织HIF-1α的表达，与模型组比较有显著性差异(P<0.05)。结果提示，通莲汤通过下调HIF-1α表达，从而抑制肿瘤血管生成。

综上所述，通莲汤有较好的抑制胃癌荷瘤裸小鼠瘤体生长作用，其抑瘤作用机制与下调瘤体组织内HIF-1α蛋白表达有关。

参考文献：

[1]廖毅,邓媛,傅建伟.胃癌分子机制的研究进展[J].中国肿瘤,2014,23(1):58-62.

[2]李伟,曹广涛,张微.缺氧诱导因子-1α在胃癌患者血清中的表达及临床意义[J].中国肿瘤外科杂志,2013,5(4):212.

[3]傅岳武,潘运龙,覃莉,等.纳米金对裸鼠肝癌HIF-1α和VEGFmRNA表达及肿瘤血管的影响[J].肿瘤防治研究,2014,41(1):5-8.

[4]陈赐慧,花宝金.中医药治疗肿瘤的优势[J].中国中医药信息杂志,2013,20(1):6-7.

[5]河北联合大学.防治胃癌的益气活血复方中药制剂及其制备方法[P].中国:ZL201310543123.5,2015-04-22.

[6]贾永森,王亚,喇孝瑾,等.通莲汤对胃癌MGC803细胞增殖及细胞周期的影响[J].时珍国医国药,2014,25(1):10-12.

[7]王亚,贾永森,喇孝瑾,等.通莲汤对胃癌MGC803细胞周期及NF-κBs信号通路的影响[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(22):213-217.

[8]贾永森,王亚,孙瑞军,等.通莲汤对荷瘤裸鼠的抑瘤作用及机制研究[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(18):133.

[9]周英泽,罗红波,王锡平,等.原发性十二指肠梭形细胞鳞癌的组织形态学及蛋白表达的研究[J].海南医学,2014,25(10):1532-1534.

[10]余柏林,李春杰,魏品康.消痰散结方干预胃癌组织增殖细胞核抗原(PCNA)表达影响的研究[J].中医药信息,2008,25(5):56-58.