凋亡相关基因c-myc在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

凋亡相关基因c-myc在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

安金路蒋军广孙曼崔永亮张艳梅郭世放宋卫卫

(郑州大学第一附属医院河南省呼吸疾病研究所河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南郑州450052)

摘要〔〕目的探讨凋亡相关基因c-myc在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及临床意义。方法免疫组织化学法检测c-myc在NSCLC(50例)及正常肺组织(20例)中的表达，TUNEL法检测凋亡细胞并计算凋亡指数(AI)。结果c-myc在NSCLC及正常肺组织间表达差异有统计学意义(χ2=9.150，P=0.002)。c-myc在腺癌中的表达率高于在肺鳞癌中(χ2=5.918，P=0.015)。高分化组织的阳性表达率高于中分化和低分化(χ2=7.888，P=0.019 )。淋巴结转移者阳性率高于无淋巴结转移者(χ2=4.327，P=0.038)。TNM Ⅲ期和Ⅳ期阳性率高于Ⅰ期和Ⅱ期(χ2=7.484，P=0.006)。c-myc与细胞凋亡指数呈负相关(r=-0.784，P=0.000)。c-myc的表达与性别、年龄、吸烟、肿瘤大小、肿瘤位置、胸腔积液无明显关系(P>0.05)。结论c-myc与NSCLC的发生、进展、临床分期、恶性程度关系密切。

关键词〔〕c-myc；肺肿瘤；细胞凋亡；免疫组织化学

中图分类号〔〕R734.2〔

基金项目：河南省科技攻关重点项目(102102310133)

通讯作者：蒋军广(1963-)，男，硕士生导师，主任医师，教授，主要从事呼吸疾病的基础与临床研究。

第一作者：安金路(1990-)，女，在读硕士，主要从事呼吸疾病的基础与临床研究。

肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤。肿瘤和凋亡关系密切，肿瘤发生的一个重要原因是诱导凋亡基因失活，抑制凋亡基因过度表达。目前对c-myc在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及临床意义已有研究，结果并不一致，而c-myc与细胞凋亡的关系研究尚少。本研究探讨c-myc在NSCLC中发生、发展中的作用，期望为NSCLC的预防、诊断、治疗提供实验依据。

1对象与方法

1.1对象随机选取郑州大学第一附属医院病理科2010～2012年经我院胸外科切除的NSCLC标本50例，年龄44～77岁，年龄≥60岁28例，<60岁22例；所有患者手术前均未接受放化疗及其他治疗且病理诊断明确。按照美国联合癌症分类委员会和国际抗癌联盟制定的TNM分期标准进行分期〔1〕。其中男33例，女17例；鳞癌27例，腺癌23例；高分化9例，中分化26例，低分化15例；有淋巴结转移24例，无淋巴结转移26例；TNM分期Ⅰ期加Ⅱ期共31例，Ⅲ期加Ⅳ期共19例；吸烟23例，不吸烟27例；肿瘤直径>3 cm者32例，≤3 cm者18例；肿瘤位于左侧20例，右侧30例；有胸腔积液者9例，无胸腔积液者41例。另选取20例距NSCLC癌旁3 cm以上正常组织(病理证实)为对照组。

1.2方法

1.2.1主要试剂Rabbit Anti-MTLC/c-myc、罗氏TUNEL凋亡检测试剂盒、免疫组化染色试剂盒来自北京博奥森生物技术有限公司；浓缩型DAB试剂盒来自北京中杉生物工程公司。

1.2.2S-P法染色50例NSCLC组织及20例正常肺组织切片放入60℃恒温烤箱里30 min；梯度酒精脱蜡、水化；磷酸盐缓冲液(PBS)抗原修复；3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性；非免疫性动物血清阻断非特异性反应；滴加一抗，放入4℃冰箱过夜；第2天滴加生物素化标记的二抗；滴加辣根酶标记链霉卵白素；DAB显色；苏木素复染；梯度酒精脱水；中性树胶封片。

1.2.3TUNEL法烤片、脱蜡、脱水；Proteinase K工作液处理癌组织切片；TUNEL反应混合液处理肺癌组织；滴加converter-POD；DAB显色；苏木素复染；梯度酒精脱水；中性树胶封片。

1.2.4阳性结果判断免疫组化结果判定：c-myc在肺鳞癌中的主要表达在细胞质，肺腺癌中主要表达在细胞质，阳性表达均呈现棕黄色颗粒。从两方面进行定量判断，①阳性染色程度：无染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。②染色细胞百分率，高倍镜(400倍)下每个视野计数100个细胞，每张切片随机挑选10个视野，计算阳性细胞数占总癌细胞数百分比，<10%为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2分，≥51%为3分。两个定量数字相加，总分值<4分为阴性，≥4分为阳性。

细胞凋亡阳性结果判定：利用TUNEL法，肿瘤细胞核被染为棕黄色，用光学显微镜，计数每1 000个肿瘤细胞中凋亡细胞的个数并进行统计学分析。需排除严重的炎症反应和坏死灶，避免造成假阳性结果〔2〕。凋亡细胞指数(AI)=凋亡细胞数/计数总细胞数。

1.3统计学处理应用SPSS17.0软件进行χ2检验、直线相关性分析。

2结果

2.1c-myc表达与临床病理的关系c-myc经免疫组化后，细胞胞质和(或)胞核被染成棕黄色，肺癌组织阳性率为60.0%(30/50)，正常组织阳性率为20%(4/20)，两者差异显著(χ2=9.150，P=0.002)，但c-myc在癌组织的染色均深于正常组织。结果显示，c-myc在腺癌中的表达率高于在鳞癌中(χ2=5.918，P=0.015)，在高分化组织的阳性表达率高于中分化和低分化(χ2=7.888，P=0.019)。淋巴结转移者c-myc阳性率较无淋巴结转移者的阳性率高(χ2=4.327，P=0.038)。TNMⅢ期和Ⅳ期c-myc阳性率高于Ⅰ期和Ⅱ期阳性率(χ2=7.484，P=0.006)。c-myc的表达与性别、年龄、吸烟、肿瘤大小、肿瘤位置、有无胸腔积液无明显关系(P>0.05)，见表1。

表1　c-myc的表达与NSCLC临床病理特征关系〔 n(%)〕

2.2c-myc与细胞凋亡直线相关分析表明，随着表达c-myc分值越高，细胞的凋亡指数越低，与凋亡呈负相关(r=-0.784,P=0.000)。其中0分AI值9.67±1.15，1～2分AI值为7.25±1.24，3～4分AI值为5.14±0.71，5～6分AI值为3.50±0.48 。

3讨论

人类肿瘤(宫颈鳞癌〔3〕、肝癌〔4〕、食管鳞癌〔5〕等)中大多可检测到c-myc的表达异常,c-myc原癌基因激活的主要方式是c-myc的扩增和过度表达〔6〕。李雪婷等〔3〕利用原位杂交技术检测c-myc mRNA的表达从CINⅠ-Ⅱ～CINⅢ直至发展到鳞癌的过程中，阳性率明显升高，c-myc基因在CIN病变即被激活，持续存在并逐渐积累于发展为宫颈鳞癌的整个癌变过程中。范平明等〔5〕应用流式细胞术发现MMP-14和c-myc在食管鳞状细胞癌组织中高表达且有协同，MMP-14、c-myc的表达与食管鳞癌细胞患者的预后有关。

项锋钢等〔7〕发现Bmi-1、c-myc蛋白在NSCLC的阳性表达率及强度均显著高于正常肺组织。与本实验结果一致，提示c-myc在NSCLC发生发展中起作用，上调c-myc的表达，可导致肿瘤细胞增生、浸润，导致NSCLC的发生，c-myc可能成为肺癌早期诊断标记物及治疗靶点。Nakashima等〔8〕发现高Wnt3表达肿瘤在肺鳞状细胞癌比在肺腺癌更高。Wnt3基因表达与c-myc的表达和survivin的表达明显相关。本实验结果提示c-myc可能成为肺腺癌早期诊断标记物及治疗靶点〔9〕。王革平等〔10〕研究发现高分化癌中c-myc 的表达低于中低分化癌，分化从高到低c-myc表达呈抛物线状趋势。项锋钢等〔7〕也发现c-myc的阳性表达与肺癌的分化程度有关，分化程度越高，阳性率越高。本实验结果提示c-myc上调可能与肿瘤的恶性程度有关，对其进行检测有可能提示NSCLC恶性程度。但赖习华等〔9〕、简丽萍等〔11〕、辛彩霞等〔12〕发现c-myc的表达与组织分化程度无统计学意义。这些文献研究结果不一致的原因可能与样本组织高中低分化程度、样本数量等因素有关。项锋钢等〔7〕发现c-myc的阳性表达与肺癌的淋巴结转移有关。赵云霞等〔13〕发现c-myc表达淋巴结转移有明显关系。本实验结果提示c-myc表达上调与NSCLC淋巴结转移有一定关系。项锋钢等〔7〕研究结果c-myc阳性表达与肺癌的TNM分期有统计学意义。本实验结果提示c-my与NSCLC的发生、进展、预后有关。另外c-myc基因上调或增加导致凋亡减少，与肿瘤的发生、发展密切相关，下调或抑制该基因可能抑制肿瘤发生发展。

4参考文献

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10王革平,陈莉.非小细胞肺癌中PGSK-3β、C-myc表达及临床意义〔J〕.现代肿瘤医学,2011;19(11):2224-6.

11简丽萍,王鸿程,孔志斌,等.STAT5、cyclinD1和c-myc蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义〔J〕.细胞与分子免疫学杂志,2007；23(12):1172-3.

12辛彩霞,左自立,王鸿程,等.STAT4、STAT6与c-myc在非小细胞肺癌组织中的表达及相关性〔J〕.肿瘤基础与临床,2011;24(4):280-3.

13赵云霞,龚晓萌,刘德纯,等.BRCA1、PTEN、Rb、C-myc和C-myb在乳腺癌中的异常表达及临床意义探讨〔J〕.中国组织化学与细胞化学杂志,2012;21(1):57-62.

〔2014-02-14修回〕

(编辑李相军/滕欣航)