重组人白细胞介素－6对胶质瘤细胞U87增生侵袭的影响

重组人白细胞介素-6对胶质瘤细胞U87增生侵袭的影响

刘雅琦顾金海1孟锐安芳玲

(宁夏医科大学，宁夏银川750004)

摘要〔〕目的探讨重组人白细胞介素(IL)-6对胶质瘤细胞U87增生、侵袭能力的影响及其机制。方法应用CCK-8法检测IL-6对U87细胞增生的影响并计算增殖率；应用Transwell小室检测IL-6对U87侵袭的影响；应用Western印迹检测IL-6对胶质瘤细胞STAT3蛋白及其磷酸化状态的影响。结果IL-6能促进U87增生和侵袭能力(P<0.05)，并伴随STAT3及p-STAT3蛋白表达上调(P<0.05)。结论IL-6通过促进胶质瘤细胞STAT3磷酸化，从而促进了胶质瘤细胞的增生侵袭能力，为脑胶质瘤的临床治疗提供了理论支持。

关键词〔〕白细胞介素-6；胶质瘤细胞U87；增生；侵袭

中图分类号〔〕R739.4〔

基金项目：国家自然科学

通讯作者：顾金海(1974-)，男，博士，副教授，主要从事人脑胶质瘤信号通路及癫痫研究。

1宁夏医科大学颅脑疾病重点实验室

第一作者：刘雅琦(1988-)，女，硕士，主要从事人脑胶质瘤信号通路研究。

Effects of recombinant human interleukin-6 on the proliferationand invasion of Human U87 Glioma Cells

LIU Ya-Qi,GU Jin-Hai,MENG Rui,etal.

Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,Ningxia,China

Abstract【】ObjectiveTo study the effect of recombinant human interleukin(IL)-6 on proliferation and invasion of Human U87 glioma cells and its mechanism.MethodsCCK-8 assay was used to detect the effect of IL-6 on proliferation of U87 glioma cells,and the relative proliferation effect was calculated.Transwell assay was conducted to study the effect of IL-6 on invasion of U87 glioma cells.Western blot was performed to investigate the change of Stat3 protein and its phosphorylation status after IL-6 treatment.ResultsThe IL-6 promoted the proliferation of U87 glioma cells(P<0.05).The invasion abilities of U87 cells were significantly promoted by IL-6 treatment(P<0.05),which was accompanied by the up-regulation of the STAT3 and p-STAT3 protein expressions.ConclusionsIL-6 could effectively promote U87 glioma cells proliferation and invasion.The phosphorylation of STAT3 might play an important role in this process.

【Key words】Interleukin-6;U87 glioma cells;Proliferation;Invasion

胶质瘤患者预后不良的原因与脑胶质瘤生物学行为有关。研究表明，白细胞介素(IL)-6在机体的免疫调节,炎症反应,造血调控等过程中均发挥重要的作用〔1〕，近年来研究发现，IL-6在膀胱癌等癌症的增生中起重要作用〔2〕。IL-6通过调节细胞的信号通路影响肿瘤细胞的生长，其中JAK2/STAT3信号通路是其中重要的一条，然而其在胶质瘤的发生发展中发挥作用的具体分子机制并不十分清晰。本研究拟探讨IL-6对胶质瘤细胞U87活化状态及分子生物学行为的影响及机制。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1细胞人脑胶质瘤细胞株U87购于上海市吉凯基因化学技术有限公司。

1.1.2主要试剂重组人白介素IL-6购自美国Pepro Tech公司，兔抗人STAT3单克隆抗体和兔抗人STAT3 Phospho(pY705)单克隆抗体购自美国Cell Signal Technology公司，兔抗人GAPDH多克隆抗体(AB-P-R 001)购自杭州贤至生物科技有限公司，辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)购自北京中杉金桥生物技术有限公司，Western印迹相关试剂购自上海双螺旋生物科技有限公司，发光液购自美国Advansta公司，全蛋白提取试剂盒和蛋白含量检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司，CCK-8试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，BD基质胶购于美国sigma公司，Transwell小室购于美国Corning公司，细胞DMEM培养基购自美国HyClone公司，胎牛血清购于北京全式金生物技术有限公司。

1.1.3主要仪器设备二氧化碳培养箱(上海力新仪器有限公司)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；PowerWave XS 全波长酶标仪(美国Bio-Tek公司)；台式高速离心机(上海力新仪器有限公司)；超纯水机(上海力新仪器公司)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养将U87细胞接种于含有10%胎牛血清和1%双抗(青霉素/链霉素)的DMEM培养基中，置于37℃、5%的CO2恒温孵育箱中培养，每3 d用0.25%的胰蛋白酶传代并消化，用对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2蛋白提取及其含量测定将U87培养在60 mm的培养皿中，当实验组细胞融合至70%～80%时，加入IL-6处理细胞(50 ng/ml培养基)30 min，将细胞用冷PBS洗两次，再加入适量新配蛋白裂解液(冰上操作)，置于4℃摇床充分裂解15 min，用细胞刮子刮取细胞，吸入EP管中，14 000 r/min、4℃离心15 min，取上清液采用BCA法测定蛋白浓度。对照组细胞做同样处理。

1.2.3Western印迹检测目的蛋白根据STAT3/P-STAT3和GAPDH蛋白分子量的大小(92 kD和37 kD)确定SDS-PAGE分离胶浓度为10%，分离胶凝后加入浓缩胶，待凝固后将终浓度为1.67 μg/μl含有Loading Buffer的蛋白样品置95℃热变形8 min，SDS-PAGE胶凝后，将其放入电泳槽，倒入电泳液后轻轻拔出梳子，将煮过的蛋白样品依次加入加样孔，每孔15 μl，Maker上样体积为5 μl。80 V垂直电泳约25～30 min，当压到两胶界限时换电压为110 V继续电泳90 min，将蛋白转至硝酸纤维素膜上90 min，用PBST配置的5%牛奶封闭1 h，4℃孵育一抗过夜，STAT3，P-STAT3和GAPDH三种蛋白抗体的浓度依次为1∶500,1∶500,1∶1 000。用PBST洗膜后在辣根酶标记山羊抗兔IgG孵育二抗室温下孵育1 h，PBST洗膜后于暗室内加入发光液显色曝光。图像用扫描仪记录，用Gelpro32软件计算其灰度值并进行统计学分析。

1.2.4CCK-8法细胞增殖实验在96孔板中接种1×103个细胞，细胞悬液体积为100 μl，各组加入IL-6浓度依次为0、25、50 ng/ml，在培养箱中培养24 h,每孔加入10 μl WST-8液，继续在培养箱中孵育2 h，用酶标仪在450 nm处测定吸光度。

1.2.5Transwell小室侵袭实验将BD基质胶用无血清培养基稀释至10 mg/ml,取100 μl铺在孔径为8 μm的聚碳酸酯滤膜Transwell小室内，避免产生气泡。置于37℃聚合2 h，将处于对数生长期的U87细胞用PBS洗3遍，胰酶消化后用无血清培养基重悬;上室加1×105个细胞，总体积200 μl，下室加600 μl含为0、25、50 ng/ml的IL-6及含100 ml/L 胎牛血清的培养基，置37℃，50 ml/L CO2培养箱中培养60 h； 取出小室，棉签擦净上室细胞并用PBS洗3遍，90%乙醇固定30 min，0.1%结晶紫染色30 min，PBS清洗3遍； 显微镜下取8个随机视野拍照，计数。

1.3统计学分析采用SPSS17.0软件行t检验。

2结果

2.1IL-6上调了U87细胞中STAT3及p-STAT3蛋白的表达Western印迹检测发现，以GAPDH 为内参，经过50 ng/ml IL-6处理30 min的U87细胞，p-STAT3(2.21±0.10)、STAT3(0.86±0.10)表达水平比较与0 ng/ml IL-6组(1.65±0.04、0.44±0.07)(P<0.05)明显升高。见图1。

图1　IL-6对U87细胞STAT3及p-STAT3蛋白表达的影响

2.2U87细胞的增生状态CCK-8结果显示，与对照组(0.99±0.11)比较，25、50 ng/ml 组的IL-6可以显著促进U87细胞的体外增殖(1.37±0.07、1.38±0.36)(P<0.05)，并且该促进作用呈一定的剂量依赖关系。

2.3IL-6促进U87细胞的侵袭Transwell结果显示，IL-6处理后的细胞明显促进了U87细胞的侵袭(图2)。在含0、25、50 ng /ml的IL-6及10%FBS的细胞培养基趋化作用下，细胞穿膜数分别为(66±15)个、(188±20)个、(336±136)个，组间比较差异显著(P<0.05)，并呈现一定的剂量依赖性。

图2　IL-6对U87侵袭作用的影响(×200)

3讨论

神经胶质瘤亦称胶质细胞瘤，是来源于中枢神经系统的原发性恶性肿瘤，发病原因尚不完全清楚，占所有颅内肿瘤的40%～50%，能够广泛高度侵袭周围正常脑实质〔3，4〕。目前治疗胶质瘤的方式有手术、放射治疗、化学治疗、基因治疗、免疫治疗及光动力治疗等，但脑胶质瘤患者的预后仍然不理想，平均生存期十分短暂。

近年来有研究发现，一些因子及其上下游信号通路在肿瘤的发生发展及转移过程中起着重要的作用，其中对STAT3的研究较为突出〔5〕。STAT3作为IL-6信号传递中的急性期反应因子，位于17q21 染色体上，含有24 个外显子，其DNA 全长4 815 bp〔6〕。研究发现，IL-6可以作为Stat3通路上游的激活信号，促进一些肿瘤细胞的信号活化〔7〕。IL-6不再仅仅只作为一个炎症因子参与炎症疾病的进程，而是在促炎和抗炎中扮演着双重角色，IL-6的表达失调会引起严重的疾病，如类风湿关节炎〔8〕、前列腺癌〔9〕、肝细胞癌〔10〕、膀胱癌〔11〕等。然而，胶质瘤细胞U87不表达IL-6R〔12〕，我们考虑IL-6是通过与表皮生长因子受体(EGFR)结合发挥作用,EGFR是一种重要的具有酪氨酸激酶(RTK)活性的跨膜受体〔13〕，IL-6激活的EGFR会募集许多下游信号，JAK2/STAT信号通路便是其中之一。因此本课题进一步探讨研究了IL-6在影响胶质瘤细胞U87生物学行为中可能存在的信号通路。

信号转导和转录活化因子家族(STATs)是参与一些细胞因子以及生长因子介导的信号转导的转录因子，在正常细胞内调控生长、增殖、分化以及凋亡等一系列生理活动〔14〕。然而，STAT3的持续激活往往会导致生长失调，导致肿瘤细胞的无限增殖、抗凋亡、侵袭、血管再生以及逃脱免疫监视。STAT3作为一种关键的细胞核转录因子，在一些细胞因子的刺激下，通过酪氨酸酶或丝氨酸酶活化，形成磷酸化的STAT3，进而在SH2功能区相互作用下形成同源或者异源二聚体，进入细胞核发挥其调节细胞生物学行为的作用。体内外实验证实，前列腺癌细胞中高表达磷酸化STAT3 蛋白，且与转移呈正相关〔15〕。本研究表明IL-6是胶质瘤发生过程中的一个重要的细胞因子，并且与通过STAT3的磷酸化促进了胶质瘤细胞U87的增生侵袭，然而在我们实验中所发现的这一机制应该不是简单的直接的关系，还有未知的其他分子机制存在，这为我们今后的进一步的研究指明了方向。

4参考文献

1Ho J,Ondos J,Ning H,etal.Chemoirradiation for glioblastoma multiforme:the national cancer institute experience〔J〕.PLoS One,2013;8(8):e70745.

2林丽艳,张慧云,何韶衡.IL-6 及其受体与炎症性疾病关系的新进展 〔J〕.中国热带医学,2008;8(4):680-2.

3Chen MF,Lin PY,Wu CF,etal.IL-6 expression regulates tumorigenicity and correlates with prognosis in bladder cancer〔J〕.PLoS One,2013;8(4):e61901.

4Pei J,Moon KS,Pan SO,etal.Proteomic Analysis between U87MG and U343MG-a cell lines:searching for candidate proteins for glioma invasion〔J〕.Brain Tumor Res Treat,2014;2(1):22-8.

5Li S,Priceman SJ,Xin H,etal.Icaritin inhibits JAK/STAT3 signaling and growth of renal cell carcinoma〔J〕.Plos One,2013;8(12):e81657.

6Zhong Z,Wen Z,Darnell JE.Stat3 and Stat4:members of the family of signal transducers and activators of transcription〔J〕.Proc Nat Acad Sci,1994;91(11):4806-10.

7Chang Q,Bournazou E,Sansone P,etal.The IL-6/JAK/Stat3 feed-forward loop drives tumorigenesis and metastasis〔J〕.Neoplasia,2013;15(7):848-62.

8Li X,Chai W,Ni M,etal.The effects of gene polymorphisms in interleukin-4 and interleukin-6 on the susceptibility of rheumatoid arthritis in a Chinese Population〔J〕.Biol Med Res Intern,2014;2014:Article 265435.

9Barathan M,Mariappan V,Shankar EM,etal.Hypericin-photodynamic therapy leads to interleukin-6 secretion by HepG2 cells and their apoptosis via recruitment of BH3 interacting-domain death agonist and caspases〔J〕.Cell Death Dis,2013;4(6):e697.

10Tsui KH,Wang SW,Chung LC,etal.Mechanisms by which interleukin-6 attenuates cell invasion and tumorigenesis in human bladder carcinoma cells〔J〕.Biol Med Res Int,2013;2013:1437-41.

11Erb HHH,Langlechner RV,Moser PL,etal.IL6 sensitizes prostate cancer to the antiproliferative effect of IFNa2 through IRF9〔J〕.Endocr Related Cancer,2013;20:677-89.

12Rahaman SO.Inhibition of constitutively active Stat3 suppresses proliferation and induces apoptosis in glioblastoma multiforme cells〔J〕.Oncogene,2002;21:8404-13.

13王宇昕.IL-6 受体与 EGF 受体相互作用增强 IL-6 诱导的 STAT3 信号转导作用研究〔D〕.兰州：兰州大学博士学位论文,2013.

14高安定,林宝顺,兰小鹏.STAT3 与肿瘤〔J〕.中国生物化学与分子生物学报,2013;29(5):397-403.

15Gu L,Dagvadorj A,Lutz J,etal.Transcription factor stat3 stimulates metastatic behavior of human prostate cancer cells in vivo,whereas Stat5b has a preferential role in the promotion of prostate cancer cell viability and tumor growth〔J〕.Am J Pathol,2010;176(4):1959-72.

〔2014-09-11修回〕

(编辑郭菁)

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