新宫颈癌肿瘤标志物P16自身抗体的表达

新宫颈癌肿瘤标志物P16自身抗体的表达

于士龙1陈健1金刚1孙宝胜2李彦豪

(南方医科大学南方医院，广东广州510515)

摘要〔〕目的研究早期宫颈恶性肿瘤、宫颈良性肿瘤和健康人群P16自身抗体表达情况。方法利用自行设计的P16表位多肽片段作为包被抗原，采用改良EliSA方法检测141例宫颈癌患者、133例宫颈良性肿瘤患者和148例健康志愿者血浆中P16自身抗体的表达情况。结果恶性肿瘤组P16自身抗体表达水平显著高于健康对照组(t=4.016，P<0.001)和良性肿瘤组(t=3.879，P<0.001)。Ⅰ期宫颈癌组和Ⅱ期宫颈癌组P16表达水平明显高于健康人群(t=7.800，P<0.001;t=5.198，P<0.001)及良性肿瘤组(t=4.466，P<0.001；t=2.288，P<0.001)，且Ⅰ期宫颈癌组与Ⅱ期宫颈癌组P16自身抗体表达水平存在差异(t=2.012，P<0.05)。宫颈癌组特异度为90%时，敏感度15.6%，曲线下面积为0.652。Ⅰ期宫颈癌组抗P16的IgG自身抗体特异度为90%时，敏感度达到了20.3%，曲线下面积为0.719。结论P16作为一种肿瘤相关抗原，其自身抗体可以反映出宫颈病变的连续发展变化，可能是早期诊断宫颈病变的一种潜在血清学标志物。

关键词〔〕自身抗体；肿瘤相关抗原；宫颈癌；P16

中图分类号〔〕R737.33〔

通讯作者：李彦豪(1953-)，男，教授，博士生导师，主要从事介入放射学研究。

1吉林省肿瘤医院介入科2吉林省肿瘤医院放疗科

第一作者：于士龙(1976-)，男，在读博士，主治医师，主要从事介入放射学研究。

相关研究表明，P16 基因是一种肿瘤抑制基因，可直接作用于细胞周期，抑制细胞分裂，使细胞周期停滞在G1期。因此，P16基因失活可能是细胞恶化的关键。肿瘤发生时，肿瘤内异常表达的蛋白、多肽等会成为肿瘤相关抗原(TAAs)，刺激机体免疫系统产生特异性自身抗体。研究表明TAA自身抗体在多种恶性肿瘤患者中表达明显升高〔1～5〕，检测肿瘤患者血清中TAAs自身抗体可达到诊断或辅助诊断相关肿瘤的目的。在我们前期的工作中，应用线性肽代替重组蛋白作为TAA抗原的ELISA法检测自身抗体，已经证实具有MHC-Ⅱ类表位的线性肽可以与自身抗体结合，并在多种肿瘤检测中具有较高的敏感性。我们已发现P16自身抗体在食管癌和非小细胞肺癌患者中表达明显高于健康人群，然而宫颈癌中肿瘤自身抗体的研究鲜有报道。本研究拟探讨P16自身抗体在宫颈肿瘤人群血清中的表达趋势及意义。

1材料与方法

1.1样品来源样品来自吉林大学第二医院300名初次确诊为宫颈癌的女性患者。均由影像学和病理组织学诊断确认，具有全面的临床资料信息，并在血浆样品采集前未进行任何抗癌治疗。同时招募150名健康女性，采集外周血作为健康对照样本。所有研究对象均为中国人，同时给予书面知情同意书，经吉林大学伦理委员会批准。由于首次就诊的晚期患者非常少，样本少见，且晚期宫颈癌的诊断方法临床上已经很成熟，所以本次研究只纳入Ⅰ期和Ⅱ期宫颈癌患者为恶性肿瘤组，剔除Ⅲ期和Ⅳ期宫颈癌的样品。另外，剔除患有严重自身免疫疾病和其他肿瘤的样本。符合研究要求的肿瘤样本共274例，其中宫颈良性肿瘤133例，恶性肿瘤141例。符合要求的健康对照148例。

1.2自身抗体检测方法采用改良的ELISA法对P16 IgG自身抗体进行检测。线性抗原肽根据人白细胞抗原Ⅱ型(HLA-Ⅱ)设计而成，能与人类p16蛋白对应并携带能被多于90%的中国人识别的重叠限制表位，纯度>95%，同时选取与人类抗原表位不相同的玉米多肽抗原作为参照抗原。合成肽用67%冰醋酸溶解，得到5 mg/ml 的抗原存储液，使用前用含有0.1%叠氮钠NaN3(S2002，Sigma-Aldrich)的磷酸盐缓冲液(PBS，P4417，Sigma-Aldrich)将P16抗原和对照玉米抗原分别稀释至10 μg/ml。将稀释后的P16抗原及对照玉米抗原以0.1 ml/孔的量包被96孔平底透明微量滴定板(产品号3590，ImmunoChemistry Technologies)。96孔板用封板膜封闭后，4℃下孵育过夜。将抗原包被的96孔板用含Tween®20的Tris盐缓冲液(TBS)清洗三次。用分析液按1∶150稀释血浆样本(100 μl/孔)，同时将分析液(100 μl/孔)加入阴性对照孔中。在37℃孵箱中孵育1.5 h后洗板3次，加入以1∶20 000倍稀释的过氧化物酶标记羊抗人IgG抗体(A8667，Sigma-Aldrich、100 μl/孔)，封板膜封闭后在37℃孵箱中孵育1 h。然后洗板3次，加入显色剂四甲基联苯胺(TMB，S1301，Life Technologies)每孔100 μl，显色20～30 min后加入50 μl终止液(10.9%的硫酸溶液)。将酶标仪波长设定为450 nm及620 nm作为参考波长，在终止反应后10 min内，测定样品的光密度(OD)值。为了避免非特异吸收信号的干扰，用特意结合指数(SBI)表示血浆中循环自身抗体P16的水平。SBI=〔P16抗原(OD)-NC(OD)〕/〔对照抗原(OD)-NC(OD)〕

1.3统计学分析采用SPSS21.0软件行独立样本t检验；利用受试者工作特征曲线(ROC)分析特异性>90%的情况下ELASA方法的敏感性。

2结果

2.1各组之间P16自身抗体表达水平比较恶性肿瘤组P16自身抗体表达水平(1.196±0.227)显著高于健康对照组(1.098±0.188)(t=4.016，P<0.001)及良性肿瘤组(1.093±0.212)(t=3.879，P<0.001)。良性肿瘤组P16自身抗体表达水平与健康对照组之间无明显差异(t=0.209，P=0.834)。P16自身抗体的表达水平在健康对照组、良性肿瘤组和恶性肿瘤组中有依次升高的趋势。

2.2不同肿瘤分期间P16自身抗体表达水平的比较Ⅰ期宫颈癌组(1.331±0.212)和Ⅱ期宫颈癌组(1.244±0.234)P16表达水平明显高于健康人群(t=7.800，P<0.001;t=5.198，P<0.001)及良性肿瘤组(t=4.466，P<0.001；t=2.288，P<0.001)。Ⅰ期宫颈癌组与Ⅱ期宫颈癌组P16自身抗体表达水平也存在差异(t=2.012，P<0.05)，有统计学意义。

2.3ROC分析恶性肿瘤组IgG检测在特异度90%时，敏感度15.6%，曲线下面积为0.652(SE=0.032，95%CI:0.588～0.715)。Ⅰ期宫颈癌组IgG检测在特异度90%、敏感度20.3%时，ROC为0.719(SE=0.039，95%CI:0.642～0.796)；Ⅱ期宫颈癌组IgG检测在特异度90%时，敏感度12.2%，ROC为0.604(SE=0.040，95%CI:0.525～0.682)。见图1。

图1　宫颈癌及其各分期中P16自身抗体的ROC分析

3讨论

大量研究表明，机体对自身肿瘤成分能够产生体液免疫反应〔6，7〕，从而产生肿瘤相关抗原自身抗体。免疫应答在癌症早期起到生物信号放大作用，使得在肿瘤抗原水平很低，利用常规蛋白检测方法无法检出时，就可以检测到该肿瘤抗原自身抗体的异常表达〔7，8〕。因此血清中自身抗体的水平对监测肿瘤的发生具有重大意义〔9〕。

研究证实P16蛋白在宫颈癌组织中表达增高〔10，11〕，过表达的P16蛋白可刺激机体免疫系统产生更多的P16自身抗体。本研究结果提示P16自身抗体可以成为宫颈癌发生的生物标记物，并且在宫颈癌发生早期具有重要的诊断价值，与Jin等〔12〕和FOXP3〔13〕自身抗体在Ⅰ期食管癌中表达最高的研究结果相类似，进一步证实自身抗体在肿瘤早期诊断的潜在作用。P16基因在宫颈癌中的表达与其抑癌基因形象并不相符，P16蛋白在宫颈癌中表达升高，并随着病变加重有逐渐升高的趋势。目前对于P16蛋白升高主要存在两种解释。首先P16蛋白的表达升高可能与Rb基因失活有关。在正常宫颈组织中pRb可抑制P16基因的表达，P16与pRb之间通过负调节维持着两者之间的精确平衡。当宫颈癌发生时，Rb基因的失活导致功能性pRb蛋白缺失，进而使得P16的抑制解除，导致P16表达升高。其次，研究报道P16的表达升高可能与HPV的感染有关。已证实HPV感染是导致宫颈癌发病的主要原因。HPV感染引起P16高表达的机制可能是HPV癌基因E6、E7编码的癌蛋白，能分别与宿主的抑癌基因产物P53和pRb结合，导致P53表达下降和pRb功能丧失，使其对P16的负反馈调节作用丧失，从而导致P16蛋白在宫颈癌中过度表达。多数肿瘤中都能检测到Rb基因的失活，但仅只发现在宫颈癌、头颈部鳞癌等少数癌中存在P16蛋白的过表达的现象。虽然宫颈癌发生中HPV感染与P16蛋白表达升高的内在机制尚不清楚，但HPV感染诱导P16蛋白表达升高为P16自身抗体作为宫颈癌的生物标记物提供了有力的理论基础。

敏感度和特异度是血清学诊断标志物重要的衡量指标。Li等〔14〕和Zhang等〔15〕分别以TAA重组蛋白为抗原检测了卵巢癌和肝癌中P16自身抗体的表达，其敏感性分别为25%和21.8%。Liu等〔16〕和Ye等〔17〕用同样方法对乳腺癌进行检测，敏感性分别为14.3%和12.2%。以上研究中发现P16自身抗体检测在腺癌中较为敏感，而在鳞癌检测中，Zhou等〔18〕以TAA重组蛋白为抗原检测食管癌，P16敏感性较低。传统肿瘤标志物在良性肿瘤中也有升高的现象，是限制诊断敏感性的因素之一。之前的研究很少纳入良性组，本研究中虽然良性组和健康组之间不存在差异，但是恶性组显著高于良性组，这也说明P16自身抗体在宫颈恶性肿瘤诊断方面具有显著优势。

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〔2014-10-17修回〕

(编辑徐杰)