液相色谱测定水产品中组胺含量不确定度评估

胡礼渊，孙高英，廖和菁

（广西东兴出入境检验检疫局，广西东兴538100）

液相色谱测定水产品中组胺含量不确定度评估

胡礼渊，孙高英，廖和菁

（广西东兴出入境检验检疫局，广西东兴538100）

根据GB/T 20768-2006鱼和虾有毒生物胺的测定原理，建立不确定度评定数学模型，评估该方法在分析过程中的不确定度来源，计算检测过程中引入的各个不确定度分量，并计算检测结果的合成不确定度和扩展不确定度。

高效液相色谱；组胺；不确定度

国际实验室认可合作组织（ILAC）在发布的国际标准17025中，要求认可实验室应用GUM评估和报告测量不确定度[1]。测量不确定度是表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相关联的参数[2]，随着食品安全问题受到越来越广泛的关注，测量不确定度可为食品检验的准确性和可靠性提供真实、有效依据。

组胺是一种低分子杂环族有机化合物，由组氨酸在摩根氏变形杆菌、组胺无色杆菌等细菌和组氨酸脱羧酶的作用下脱去羧基后形成，是生成致癌物质和亚硝基类物质的前体，也是生物胺中毒性最大的胺类，对人体健康的危害极大。我国规定鲐鱼中组胺含量≤100mg/100 g，其他鱼类中组胺含量≤30mg/100 g。本次实验根据测量不确定度评定的通用准则[1-2]对GB/T 20768—2006《鱼和虾中有毒生物胺的测定》进行了不确定度评定，为该方法的控制和检测报告的评估提供参考，最终给出测量结果的置信区间和置信水平。

1 实验部分

1.1 方法原理

试样中的组胺用高氯酸溶液提取，经丹酰氯衍生化后，用液相色谱—紫外检测器检测，外标法定量。

1.2 设备和色谱条件

1.2.1 设备

AgiLent高效液相色谱仪1200：配有紫外检测器；离心机：最高转速5 000 r/min；均质机，移液器10μL～100μL和100μL～1 000μL。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：AgiLentC18；流动相：A 0.01moL/L乙酸铵；B水+乙腈（10+90）含0.01moL/L乙酸铵；流速：1.0mL/min；检测波长：254 nm；柱温35℃；进样量：10μL。

1.3 测定步骤

称取2 g样品，精确至0.01 g，置于50mL离心管中，加入10 mL 0.4 moL/L高氯酸溶液，均质1 min，4 000 r/min离心5min，上清液移入25mL容量瓶中，沉淀物用10mL 0.4moL/L高氯酸溶液重复提取1次，合并上清液，用0.4moL/L高氯酸定容至刻度。取1.0mL提取液加入5m L容量瓶中，依次加入0.1m L 2moL/L氢氧化钠溶液、0.3mL饱和碳酸氢钠溶液和2mL 10mg/mL丹酰氯溶液，盖塞，于40℃避光反应45min，然后加入0.1mL 25%～28%氢氧化铵，静置30min，用乙腈定容到刻度，取1mL过0.45μm滤膜进样，紫外检测器检测。自动进样器吸取标准使用液10μL注入进样口，制得色谱图。校准曲线取5个浓度点，重复两次进样，以峰面积响应值对标样浓度绘制工作曲线，外标法定量，计算标准平均峰面积。同时作空白实验，测量两份样品，将样品平均峰面积和标准平均峰面积比较计算。

2 数学模型

式中：X为样品中组胺的含量，（mg/kg）；C为从标准曲线得到的试样溶液中组胺的浓度，（μg/mL）；V为试样溶液定容体积，mL；m为最终试样溶液所代表的试样质量，g。

3 不确定度来源及其评定

3.1 不确定度分量来源及构成图

根据实验过程及数据模型分析，组胺含量测定的测量不确定度来源主要包括：测量重复性相对标准不确定度、线性最小二乘法拟合曲线引入的相对标准不确定度、标准溶液配置的相对标准不确定度。其中，标准溶液产生的不确定度由两个部分组成。一部分是标准物质本身引起的不确定度；另一部分是标准溶液稀释过程引起的不确定度，其中包括玻璃量器容量误差引起的不确定度、定容体积、温度的变动以及天平称重引起的不确定度。具体构成如图1所示。

图1 不确定度分量来源及构成图Fig.1 Sources of uncertainty components and structural diagram

3.2 标准溶液配置引入的不确定度

3.2.1 质量引起的不确定度

3.2.1.1 标准物质纯度的不确定度

组胺标准物质证书标明的纯度为99%，不确定度为0.5%，按正态分布，扩展因子K=3，其相对标准不确定度U1reL=0.5/3×99=0.001 7

3.2.1.2 天平称重的标准不确定度

用1/1 000天平称量0.016 57 g标准物质，证书给出：0≤M≤50 g称量误差为±0.000 1 g，按矩阵分布考虑，扩展因子。

3.2.2 温度的变动引起的标准不确定度

组胺标准溶液的浓度是在20℃条件下标定的，假设实验室温度变化介于±2℃之间，按矩阵分布考虑，扩展因子，水20℃的膨胀系数为2.1×10-4。

3.2.3 体积测量的标准不确定度

3.2.3.1 定容体积引起的不确定度

标准溶液用10mL的容量瓶定容，根据JJG196-2006《常用玻璃仪器检定规程》，A级10mL容量瓶的最大允差为±0.02mL，按矩阵分布考虑。

3.2.3.2 标准溶液稀释引起的标准不确定度

配置标准溶液使用到1 000μL和100μL的移液器，根据检定证书得知1 000μL的移液器不确定度为0.5%，100μL的移液器不确定度为0.1%，按矩形分布考虑。

体积测量引起的不确定度

因此，标准溶液配置的相对标准不确定度为：

3.3 测量重复性标准不确定度

测量结果的重复性主要受样品处理过程操作的一致性、样品均匀性和仪器性能的影响，属于A类评定，可以通过取标准曲线中间浓度加标测定，测定10个相同浓度标样的样品，检测结果详见表1。

单次测量结果的标准偏差按下式计算：

在日常的分析中，测量两份样品，报告平均值。两次测量结果平均值的相对标准偏差：

表1 相同浓度的10个标样检测结果Table 1 The same concentration of10 standard test results

此分量综合体现了测量仪器、体积测量、质量测量和回收率等各方面的随机影响。因此，在评定其它分量时不再考虑这些随机影响。

3.4 定容后溶液浓度预估值的不确定度评定

标准曲线取5个点，每个浓度点重复进样2次，结果如表2。

表2 重复2次测5个标准点的峰面积Table2 Repeat two times five standard points measured peak area

标准曲线一次方程为：Y=20.329X+4.585 7

样品精制浓缩液定容后的浓度通过拟合标准曲线确定，由标准曲线引入的标准不确定度按下式计算

式中：p为试样平行测量次数；n为拟合直线的数据对数；y为试样测量响应值（p个）的平均值；y为绘制拟合曲线响应值（n个）的平均值；xp为试样测量预估值；x为绘制拟合直线输入值xi（n个）的总平均值；yi-yfi为是输入值为xi时，仪器响应值与拟合直线上对应的响应值之差。

把xi分别代入Y=20.329X+4.5857得yfi，则。在本测量中，试样测量响应值y1=400.7，y2=392.5。利用拟合直线计算得到精致浓缩液定容后浓度：xp=19.3μg/mL。n=10，p=2，。

把相关数据代入上述公式计算得到由标准曲线引入的标准不确定度：s（xp）=0.235 4μg/m L。其相对标准不确定度为

4 不确定度分量列表

测定水产品中组胺含量不确定度各影响量的相对不确定度见表3。

表3 水产品中组胺测量不确定度分量Table3 Aquatic histamine measurement uncertainty components

5 合成不确定度

标样中组胺含量X的合成标准不确定计算如下：

6 扩展不确定度

置信区间95%，取包含因子k=2，扩展不确定度为：U（X）=k×uc（X）=2×4.2=8.4mg/kg

7 结果报告

用高效液相色谱—紫外检测法按GB/T 20768—2006规定的条件测定水产品中组胺的含量为（235.0± 8.4）mg/kg，包含因子k=2（95%置信区间）。

8 讨论

从上述不确定度的评定分析得知，本方法测量结果的不确定度主要来源有三部分，其中，重复测量和拟合曲线引入的不确定度较为显著，为主要来源。因此，在测量过程中，通过提高操作人员的检测水平和熟练程度，保证样品前处理过程的平行性，增加曲线中浓度点数值等措施，减小不确定度的数值，可获得较为可靠的检测结果。

[1]中国实验室国家认可委员会.CNAS-GL06:2006化学分析中不确定度的评估指南[M].北京:中国计量出版社,2006

[2] 国家质量技术监督局.JJF1059-1999测量不确定度评定与表示[M].北京:中国计量出版社,1999

[3] 国家质量技术监督局.JJG196-2006常用玻璃量器检定规程[S].北京:中国计量出版社,2007

[4]中国国家标准化管理委员会.GB/T 20768-2006鱼和虾中有毒生物胺的测定液相色谱-紫外检测法[S].北京:中国标准出版社, 2006

[5]曹玲,吴嫣艳,张妤琳,等.高效液相色谱法测定保健食品中西地那非的不确定度评定[J].广州:现代食品科技,2012,28(7):890-893

[6]赵中辉,林洪,王林,等.常见水产品中生物胺的调查及分析[J].水产科学,2012,31(6):363-366

Determination of Histamine Content Aquatic Evaluation of Uncertainty by HPLC

HU Li-yuan，SUN Gao-ying，LIAO He-jing
（Dongxing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dongxing 538100，Guangxi，China）

According to GB/T 20768-2006 toxic biogenic amines in fish and shrimp measurement principle，the establishment of Uncertainty mathematical model to evaluate the method in the analysis of the sources of uncertainty，calculate the detection process introduced various uncertainty component，and calculate test results combined uncertainty and expanded uncertainty.

HPLC；histamine；uncertainty

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.028

2013-08-16

胡礼渊（1979—），男（汉），助理工程师，主要从事水产品检测工作。