新疆昆仑雪菊总黄酮含量测定方法研究

杜鹃，吴忠红

（1.新疆农业职业技术学院园林科技学院，新疆昌吉831100；2.新疆农业科学院，农产品贮藏加工所，新疆乌鲁木齐830091）

新疆昆仑雪菊总黄酮含量测定方法研究

杜鹃1，吴忠红2

（1.新疆农业职业技术学院园林科技学院，新疆昌吉831100；2.新疆农业科学院，农产品贮藏加工所，新疆乌鲁木齐830091）

以芦丁为标准品，对NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法和AlCl3法测定新疆昆仑雪菊总黄酮含量的结果作了比较。结果表明：NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法的测定结果比AlCl3法对于高原雪菊和平原雪菊分别约高19.76mg/mL和9.34mg/m L，AlCl3法适宜酸度为pH>5.5。邻苯二酚干扰实验表明，平均误差为0.019mg/L，随着邻苯二酚量的增加，测得值无上升趋势。AlCl3法的线性方程为：A=0.000 638+0.862 3C，r2=0.999 2。因此，对含酚类、酸类较多的昆仑雪菊应采用三氯化铝法测定其总黄酮的含量。

雪菊；黄酮；NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法；AlCl3法

雪菊[1-2]是生长在新疆和田部分山区，海拔3 200m以上的雪山之隅及喀喇昆仑山脉的野生蛇目菊，所以又称昆仑雪菊、天山雪菊，是目前新疆惟一与雪莲齐名，具有独特功效的稀有高寒植物。长期以来，昆仑雪菊被和田当地居民当花茶饮用，可治疗燥热烦渴、高血压、心慌、胃肠不适、食欲不振、痢疾及疮疖肿毒。

黄酮含量测定的方法有多种，其中络合法在黄酮测定使用较普遍，可以克服被测液基底的影响，但是与被测液成分有很大关系，络合剂及酸度的选择非常重要。目前对雪菊的研究甚少，尤其是化学成分方面。有学者[3]采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法测定了雪菊中黄酮活性物质，据报导[4-5]雪菊中还含有绿原酸、邻苯二酚等具有邻苯二羟基结构，碱性环境下与铝离子形成络合物，可能会对黄酮的测定造成干扰，影响总黄酮的测定。本实验分别用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法和AlCl3法比较雪菊总黄酮含量测定结果，期望建立一种简单、快速测定新疆昆仑雪菊中总黄酮含量的方法，以期为昆仑雪菊质量控制和开发利用提供科学参考。

1 材料与来源

1.1 材料

采自2个不同地点的昆仑雪菊样品分别为新疆和田皮山县克里阳高原雪菊（生长海拔3 200m左右）、新疆达坂城平原雪菊（生长海拔1000m左右）。

1.2 化学试剂

亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、氯化铝、醋酸、醋酸钠、乙醇、氨水、盐酸、醋酸铅、镁粉均为分析纯、芦丁（标准品）上海金穗生物有限公司。

1.3 仪器设备

FA2004电子天平：上海仪器天平厂；722型可见分光光度计：上海光谱仪器分析有限公司；PHS-3C-11A型精密pH计：中国上海雷磁新泾仪器公司；KS-300EⅡ型超声波清洗机：宁波海曙科生超声设备有限公司；Edwards Pirani1001冷冻干燥器（U.K.）；DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。

2 方法

2.1 供试样品溶液的制备

采用超声波提取法[6-7]。将2种雪菊样品粉碎，过60目筛，分别称取干燥的昆仑雪菊粉各5 g，加95%乙醇50mL，于超声波清洗机中提取10min，趁热减压抽滤，用80%乙醇定容至100mL，摇匀后再稀释5倍即得样品溶液。

2.2 黄酮类成分的定性实验[8]

2.2.1 盐酸—镁粉反应

分别取2种雪菊色素提取液5mL，加入少许镁粉，振荡后，再加入2滴36%盐酸，观察颜色变化。

2.2.2 中性醋酸铅反应

分别取2种雪菊色素提取液5mL，逐渐滴加新配制的饱和中性醋酸铅溶液，观察颜色变化。

2.2.3 浓氨水试验

分别用2种雪菊色素提取液点在纸上，用浓氨水熏蒸，紫外灯下观察。

2.3 芦丁标准品溶液的配制

精密称取120℃干燥至恒重的芦丁对照品105.8mg，置100mL容量瓶中，用少量甲醇加热溶解，冷却后甲醇定容至刻度，摇匀，即得浓度为1.058mg/mL的芦丁标准品溶液。

2.4 两种黄酮含量的测定方法

2.4.1 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法[9]测定雪菊总黄酮含量

分别吸取上述芦丁标准液0.00、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL比色管中，用50%乙醇稀释至5.00m L，分别加入5%NaNO2，试液0.3m L，摇匀，静置6min。再加5%A1（NO）3试液0.3mL，摇匀，静置6min，再加4%NaOH4ml，并用50%乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，静置12min。于510 nm[10]处测试，以显色液中芦丁的浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法测定雪菊中总黄酮含量的标准曲线见图1，用最小二乘法进行回归，得线性方程：A= 0.004 71C+0.0136，r2=0.999 5。线性范围为5.9μg/mL～59μg/mL。

取1.0m L样品溶液10m L容量瓶，以不加样品溶液为空白，按“2.4.1项”下的条件测定吸光度，参照标准曲线计算浓度，平行测定3次取其平均值。

2.4.2 AlCl3法测定雪菊中总黄酮含量

分别精密吸取上述芦丁标准液0、2．0、3．0、4．0、5．0、6．0、7．0m L于25m L的比色管中，加入1.5%AlCl38mL和醋酸-醋酸钠的缓冲液（pH5.5）4mL，并用50%乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，静置0.5 h。于415 nm下测试，以吸光度值为纵坐标，以显色液中芦丁的浓度为横坐标，AlCl3法测定雪菊中总黄酮含量的标准曲线见图2，用最小二乘法进行回归，线性方程为A= 0.000 638+0.862 3C，r2=0.999 2。

图2 AlCl3法芦丁标准曲线Fig.2 A lC l3method of rutin standard curve

取1.0m L样品溶液10m L容量瓶，以不加样品溶液为空白，按“2.4.2项”下的条件测定吸光度，参照标准曲线计算浓度，平行测定3次取其平均值。

2.5 干扰实验

为了保证测定结果不受酚类物质影响，做如下实验：以芦丁为被测试样，邻苯二酚为干扰剂（邻苯二酚是雪菊中酚类物质的代表之一，含有邻位多羟基），按标准曲线的测定方法测定，准确移取0.1mg/mL芦丁3.0mL 7份，分别准确加入0.1 g/L邻苯二酚溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL，再依次加入8mL 0.1mol/L AlCl3和4mL醋酸-醋酸钠的缓冲液（pH5.5），用50%乙醇溶液定容。

2.6 酸度对测定结果的影响

分别配制 pH为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0醋酸-醋酸钠缓冲溶液，吸取2mL 0.1 g/L芦丁标准溶液和1．5%AlCl38mL 5份，分别加入不同pH的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，50%乙醇溶液定容。

3 结果分析

3.1 黄酮类成分的定性实验

经盐酸-镁粉反应、中性醋酸铅实验、浓氨水反应检验，均呈阳性。根据本实验及有关资料证实，新疆昆仑雪菊的乙醇提取液中确实存在黄酮类成分。

3.2 两种黄酮测定方法的比较

NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法与AlCl3法测定结果见表1。

表1 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法和A lC l3法测定结果比较Table1 Com parison of NaNO2-Al（NO3）3-NaOHmethod and AlC l3method for the determination of results

由表1可知，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法的测定结果偏高，和田高原雪菊和达坂城平原雪菊的测定结果分别高出19.76mg/m L和9.34mg/m L，而用AlCl3法两种雪菊测定得出的结果则相对偏低。

NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法源于芦丁含量测定法，并逐步用于黄酮类化合物的测定。后来发现这并不是黄酮类化合物的专属反应，因为凡具有邻苯二羟基的物质，均能用此法进行显色测量。雪菊中含有邻苯二酚及花色素等多酚类物质，这些物质都具有邻苯二羟基结构，显色反应后在510 nm有很强吸收，显然会对黄酮的测定造成干扰，所以该法测定结果偏高。A1C13法在酸性环境下，只与酮羰基和其邻位羟基发生络合，反应如下所示。

A1C13法测定时，芦丁、黄芪苷、槲皮素等黄酮类物质反应强烈，而对酚酸类、原花色素的反应很小，该法对黄酮类化合物的专属性较强，适用于雪菊黄酮含量的测定，因此，选用A1C13法对雪菊中的黄酮进行定量测定较适宜。

3.3 干扰实验

不同添加量的邻苯二酚对实验结果的影响见表2。

表2 不同添加量的邻苯二酚对实验结果的影响Table 2 Effects of adding different amount of catechol on experimental results

由表2可见，测得量与实际量略有差异，平均误差0.019mg/mL。但随着邻苯二酚的增加，测得值无上升趋势，因此用AlCl3法测定雪菊中黄酮的含量，不受酚和酸类物质的影响。

3.4 酸度对测定结果的影响

实验表明，随着酸度的降低，最大吸收峰位置逐渐红移，pH大于5时，最大吸收峰位置稳定，位于415nm；吸光度值最高并且稳定。用酸度计对缓冲溶液和发色后的测试液进行测试，发现pH大于5.5时，测试液与缓冲溶液的差值最小。实验选定pH 5.5作为测定用缓冲溶液。

4 结论

本实验用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法和AlCl3法测定新疆昆仑雪菊总黄酮含量的结果作了比较。结果表明，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法的测定结果比AlCl3法对于高原雪菊和平原雪菊分别约高19.76mg/mL和9.34mg/mL，AlCl3法在酸性环境下进行，酸度实验显示，适宜酸度为pH>5.5。邻苯二酚干扰实验表明，平均误差为0.019mg/mL，随着邻苯二酚量的增加，测得值无上升趋势。AlCl3法的线性方程为：A=0.000 638+ 0.862 3C，r2=0.999 2。因此，对含酚类、酸类较多的昆仑雪菊应采用三氯化铝法测定其总黄酮的含量。

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Study on Determination of Total Flavonoids Content in Xinjiang Kunlun Snow Chrysanthemum

DU Juan1，WU Zhong-Hong2
（1.Xinjiang Agricultural Vocational Technical College，Institute of Science and landscape architecture，Changji 831100，Xinjiang，China；2.Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Research Institute of Agricultural Products Storage and Processing，Urumqi830091，Xinjiang，China）

With rut in as the standard substance，comparing the NaNO2-Al（NO3）3-NaOH determination of total flavonoids content in Xinjiang Kunlun snow chrysanthemum method and AlCl3method.The results showed that：NaNO2-Al（NO3）3-NaOH assay results than the AlCl3method for the Plateau snow chrysanthemum and plain snow chrysanthemum was approximately 19.76mg/mL and 9.34 mg/mL，AlCl3acidity was pH>5.5.The experiment showed that the catechol interference，the average error was0.019mg/L，with the increase of the measured value of catechol，no upward trend.Linear equation AlCl3method was A=0.000 638+0.862 3C，r2=0.999 2.Therefore，determination of the total flavonoids of phenols，acids more Kunlun snow chrysanthemum should be adopted AlCl3method.

snow chrysanthemum；flavonoids；NaNO2-Al（NO3）3-NaOH method；AlCl3method

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.024

2014-01-17

自治区高校科研计划项（XJEDU2013S52）

杜鹃（1979—），女（汉），讲师，硕士，从事食品加工教学及研究工作。