表面活性蛋白A在固有免疫中的作用及机制分析

表面活性蛋白A在固有免疫中的作用及机制分析

刘玉红

(湖南省辰溪县黄溪口中心医院湖南辰溪419500)

摘要目的：分析表面活性蛋白A(SP-A)在固有免疫中的作用及机制。方法：①将大肠杆菌培养至稳定期，将其分为SP-A组(SP-A 25mg/L)、BSA组(BSA 25mg/L)、空白对照组，200r/min，37℃培养，观察SP-A对大肠杆菌的凝集影响。②采用Ficoll密度梯度离心法将健康志愿者外周血进行分离，将单核巨噬细胞分离，分为SP-A组(SP-A 25mg/L)、空白对照组。在显微镜下观察大肠杆菌被单核巨噬细胞吞噬画面并摄像。③将大肠杆菌培养至稳定期，将其分为SP-A组(SP-A 25mg/L)、BSA组(BSA 25mg/L)、空白对照组，200r/min，37℃培养6h，并测定光密度值(OD)，分析SP-A对大肠杆菌的生长影响。结果： ①SP-A组大肠杆菌发生凝集，②单核巨噬细胞加入SP-A后对大肠杆菌的摄取明显增加，③加入BSA大肠杆菌生长无显著变化(P>0.05)，加入SP-A大肠杆菌生长变化显著(P<0.05)。结论： SP-A可促进大肠杆菌凝集，抑制大肠杆菌生长，并促使单核巨噬细胞摄取大肠杆菌的量增加，从而发生固有免疫作用。

关键词表明活性蛋白A；固有免疫；大肠杆菌；作用机制

【中图分类号】R446.63

尿路感染是较为常见的一种泌尿系统疾病，是成年人群中最常见的一种感染性疾病，大肠杆菌是引起尿路感染最常见的一种致病菌，表面活性蛋白A(surfactant protein A，SP-A)是一种天然免疫分子，最早发现于肺组织，在调节炎性反应及肺部免疫反应方面起重要作用[1]。本次研究通过观察SP-A对大肠杆菌的凝集和生长，以及单核巨噬细胞对大肠杆菌的摄取，分析表面活性蛋白A在固有免疫中的作用及机制，现将方法及结果报道如下。

1. 材料与方法

1.1 试剂与细胞

大肠杆菌ATCC 8739(上海复祥生物科技有限公司)，紫外分光光度计(上海奥析科学仪器有限公司)，Ficoll分离液(上海研谨生物科技有限公司)，瑞氏-吉姆萨复合染色液(上海哈灵生物科技有限公司)，表明活性蛋白A(北京华迈科生物技术有限责任公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 观察SP-A对大肠杆菌的凝集作用

采用分区划线法，将大肠杆菌接种于LB培养基，37℃培养箱内倒置已接种的培养基培养24h，在2ml的LB培养基中加入单克隆大肠杆菌，200r/min培养15h，将其培养至稳定期，试验分为SP-A组(SP-A 25mg/L)、BSA组(BSA 25mg/L)、空白对照组。200r/min，37℃摇床培养。1h后，观察显微镜下大肠杆菌的形态并摄像。

1.2.2 观察SP-A对大肠杆菌的生长作用

采用分区划线法，将大肠杆菌接种于LB培养基，37℃培养箱内倒置已接种的培养基培养24h，在2ml的LB培养基中加入单克隆大肠杆菌，200r/min培养15h，将其培养至稳定期，试验分为SP-A组(SP-A 25mg/L)、BSA组(BSA 25mg/L)、空白对照组。200r/min，37℃摇床培养6h，每小时采用600nm波长紫外分光光度计进行光密度值测定，并对大肠杆菌生长曲线进行绘制。

1.2.3 观察SP-A影响单核巨噬细胞摄取大肠杆菌的作用

采用Ficoll密度梯度离心法将单核巨噬细胞分离，将实验分为SP-A组(SP-A 25mg/L)、空白对照组。加入UPEC，不断震荡的在37℃下孵育1h，为阻止其吞噬作用，加入1ml冷PBS，采用瑞氏-吉姆萨复合染色液快速染色，在显微镜下观察大肠杆菌被单核巨噬细胞吞噬画面并摄像。

1.3 统计学处理

采用SPSS14.0专业统计学软件进行数据分析检验，计量资料录入形式为"±s"，两组间比较采用t检验，当P<0.05时，表示统计学差异具有显著意义。

2. 结果

2.1 大肠杆菌的凝集

SP-A组、空白对照组、BSA组三组均可见到活动的细菌，其中，空白对照组，BSA组大肠杆菌未发生凝集现象，SP-A组凝集呈团块状，活动性显著降低。

2.2 大肠杆菌的生长

在0h、1h侧大肠杆菌OD值，SP-A组与空白对照组比较无显著差异(P>0.05)，在2h后，比较SP-A组与空白对照组OD值，相同时间点SP-A组明显降低，P<0.05，加入BSA后无明显差异，P>0.05，详见表1。

表1　不同时间细菌生长OD值变化(x±s)

注：空白对照组与SP-A组比较，#P<0.05，空白对照组与BSA组比较，*P>0.05。

2.3 观察单核巨噬细胞细胞摄取细菌

SP-A组的大肠杆菌呈团块状凝集，单核巨噬细胞摄取大肠杆菌的量明显增加，空白对照组可见单核巨噬细胞周围分散的大肠杆菌。

3. 讨论

表面活性蛋白A是由6个三聚体平行排列而形成的，含有半胱氨酸的N末端，研究表明，表面活性蛋白A因为其独特的结构，在调节炎性反应及肺部的免疫反应方面起着极其重要的作用[2]。表面活性蛋白A的球部CRD能结合巨噬细胞表面的信号调节蛋白，抑制信号传递系统活化，从而抑制炎性反应细胞因子，促进巨噬细胞吞噬炎性反应细胞，防止炎性反应，减轻组织损伤[3]。

本次研究在LB细菌培养液中加入表面活性蛋白A，加入后，发现大肠杆菌的凝集呈团块状，其活动性显著降低，在未加入表面活性蛋白A的 空白对照组及BSA组，大肠杆菌未发生凝集，散乱分布在四周。作用2h后，测量SP-A组、BSA组、空白对照组三组的细菌光密度值，与BSA组及空白对照组比较，SP-A组大肠杆菌光密度值OD显著下降，即细菌量显著减少，P<0.05，统计学差异具有显著意义。说明表面活性蛋白A能抑制大肠杆菌的生长，随着时间延长，抑制效果越显著。研究表明，表面活性蛋白A能增加细胞膜的通透性，从而使细菌发生凝集，抑制革兰阴性菌增殖[4]。根据上述研究结果可推测，表面活性蛋白A既能避免过度的炎症反应，又对清除病原体保护机体有利，维持了免疫稳态。

综上所述，表面活性蛋白A能直接抑制大肠杆菌的生长，且能够增加单核巨噬细胞摄取大肠杆菌，并促进大肠杆菌发生凝集，有利于清除细菌，从而改善炎症反应状态，说明表面活性蛋白A在固有免疫中起着极其重要的作用，为治疗慢性肾盂肾炎提供了新策略，对相关疾病的防治具有深远意义。

参考文献

[1]牛伟静,丁国华,胡凤琪，等.表面活性蛋白A在固有免疫中的作用及机制[J].武汉大学学报(医学版),2014,35(2):202-204,208.

[2]陈芳,舒晓明,王冬雪，等.血清肺表面活性蛋白-A,D检测在多发性肌炎/皮肌炎合并间质性肺病中的意义[J].中华医学杂志,2012,92(31):2182-2185.

[3]胡凤琪,袁海,王桂荣，等.表面活性蛋白A及D在小鼠尿路感染中的作用及机制[J].中华肾脏病杂志,2013,29(6):439-443.

[4]常绍鸿,栾斌.毛细支气管炎患儿血清肺表面活性蛋白A测定及其意义[J].中国小儿急救医学,2012,19(4):424-425.