响应面优化传统发酵豆酱风味物质萃取条件的研究*

韩翠萍，汤慧娟，赵 月，王宗莹，程建军，田 波，李 杨，谢凤英

（东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030）

响应面优化传统发酵豆酱风味物质萃取条件的研究*

韩翠萍，汤慧娟，赵 月，王宗莹，程建军，田 波，李 杨，谢凤英

（东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030）

本研究采用顶空固相微萃取方法（HS-SPME）优化黑龙江传统发酵豆酱风味物质萃取条件，结合响应面试验并考虑到实际操作条件，得出了最佳萃取条件为：萃取温度62℃，萃取时间41 min，解析时间2 min。风味物质检测鉴定采用顶空固相微萃取和气质联用法，对发酵一个月的传统豆酱样品进行鉴定，共鉴定出34种挥发性风味物质成分，主要包括烷烯烃类、酯类和芳香类，这些物质对黑龙江省传统发酵豆酱风味贡献最大，可能为黑龙江省传统发酵豆酱的特征风味物质。

传统豆酱；风味物质；顶空固相微萃取；气质联用；响应面法

黑龙江传统发酵豆酱是由环境中的微生物自然发酵酿造而成，其风味物质成分非常的复杂。目前，比较常用的风味物质提取方法主要为同时蒸馏萃取法（Simultaneous Distillation and Extraction，SDE），顶空法（Head Space）及固相微萃取法（Solid Phase Microextraction， SPME）等[1]。其中固相微萃取方法不使用有机溶剂，是采样，萃取，浓缩，进样一体化，并能与气相色谱联和使用，具有非常独特的优势。本研究以黑龙江省传统发酵豆酱作为研究对象，采用顶空固相微萃取结合响应面法优化风味物质萃取条件，结合气质联用（GC-MS），对风味物质成分进行鉴定。对分析黑龙江传统发酵豆酱中风味物质的成分和组成具有重大意义[2]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：豆酱为试验自制，制作方法参考汤慧娟等的方法[3]。

仪器：DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，河南省予华仪器有限公司；固相微萃取（SPME）装置，美国Supelco公司；7890N/ 5975MSD风味检测气质联用仪，美国Agilent公司；GC-2014AFSPL气相色谱仪，日本岛津公司。

1.2 试验方法

1.2.1 单因素试验对萃取风味物质条件的优化 通过对风味物质萃取时间（10、20、30、40 min）、萃取温度（40、50、60、70℃）、固相微萃取纤维头（PDMS、PDMSDVB、PDMSCARBDVB）、解析时间（1、2、3、4 min）进行单因素试验研究，确定萃取最佳试验参数。

1.2.2 HS-SPME萃取挥发性的风味化合物 取50 mL酱醅加入到样品瓶中，放入60℃的水浴中平衡30 min后，将已老化好的萃取针头小心插入样品瓶中，再用手柄将里面的石英纤维头推出来暴露在样品瓶的顶空气体中，60℃恒温萃取40 min，再用手柄将纤维头推回到针头内，再将萃取针头拔下，插入到GC-MS进样器中进行解析。

1.2.3 GC-MS分离分析 色谱条件：DB-5，0.25mm ×60 m ×0.25 um；进样口温度为250℃；载气He，流速1.0 mL/min，不分流；程序升温：起始温度80℃，保持5 min，然后再以5℃/min升温速度直接升温至250℃，再保持10 min。质谱条件：电离方式EI，发射电流 350 μ A，电子能量 70 eV，离子源温度200℃，质量范围33～450 amu，接口温度250℃。

1.2.4 响应面试验对萃取风味物质条件的优化 采用可旋转中心组合设计方法进行试验设计，以萃取时间、萃取温度和解析时间为自变量，以总峰面积为响应值，设计3因素3水平的响应面试验。

1.2.5 挥发性风味化合物的鉴定 实验数据处理由Xcalibur软件系统完成，未知化合物通过计算机检索的同时与NIST谱库和Wiley谱库相匹配，当且仅当正反匹配度都大于800（最大值为1 000）的时候，鉴定结果才可报道。化合物的相对含量确定是通过面积归一化法。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同萃取时间对风味的影响 萃取时间主要是指达到平衡时所需要的时间，即从萃取纤维头与待测物质接触到萃取平衡时所需要的时间。由图1可以看出，随着萃取时间的延长，萃取所得风味物质的总峰面积越高，萃取出的挥发性物质的种类越多，但萃取时间也不宜过长，因大多风味物质都是挥发性物质，由于分子热运动，分子可能从吸附图层挥发出去[4]。从总峰面积和萃取峰数量考虑，得出萃取时间在40 min时，萃取所得风味物质种类和数量最多，能完全展现风味物质。

图1 不同萃取时间对风味的影响

2.1.2 不同萃取温度对风味的影响 由图2可以看出，当萃取温度为40～60℃时，随着萃取温度的升高，萃取所得风味物质的总峰面积越高，当萃取温度达60℃时，萃取峰总面积最高，萃取峰数量也达到最大，为36个；之后温度过高，萃取效果开始下滑，可能是温度过高加剧了分子热运动，热解或聚合部分的挥发性物质，从而使挥发性分子解脱吸附层[5-6]。因此在萃取过程中应时刻注意温度变化[7-8]，故确定最佳萃取温度为60℃。

2.1.3 不同解析时间对风味的影响 由图3可以看出，随着解析时间的延长，总峰面积和萃取峰数量都呈先增加后下降的趋势。可能是因为在高温状态下增加了固相微萃取纤维头涂层的极性，随之增强了对挥发性成分的吸附，进样口压力过高，挥发性成分进入到气相色谱的可能性就降低了[9]。但从总体上看，解析时间对风味物质的总峰面积影响不大，总峰面积都在8 000 000以上。但为得到更多的风味物质，故选择总峰面积最高的解析时间2 min。

图2 不同萃取温度对风味的影响

图3 不同解析时间对风味的影响

2.1.4 不同固相微萃取纤维头对风味的影响 影响萃取效果的关键因素是萃取纤维头涂层的种类和厚度，根据涂层“相似相溶原理”，极性涂层吸附极性化合物有较好的效果，非极性涂层吸附非极性化合物有较好的效果[10]。由图4可以看出，不同的固相微萃取纤维头萃取出来的风味物质不同，所得的总峰面积不同和萃取峰数量也就不同。综合考虑，为得到更多的风味物质，故选择总峰面积最高和萃取峰数量最多的固相微萃取纤维头PDMS/ CARB/DVB。

图4 不同解析时间对风味的影响

2.2 响应面分析及试验结果

在单因素试验结果的基础上，以萃取时间、萃取温度、解析时间为自变量，总峰面积为因变量，根据可旋转中心组合设计方法，进行3因素3水平试验优化萃取条件。试验因素水平设计及试验结果见表1。

由表2可以看出，B、C的影响极显著，A的影响显著。AB、BC的交互作用不显著，AC的交互作用显著。所有的因素中，影响较大的是一次项和平方项，影响较小的是交互项。P值＜0.05，说明这个模型的因素都具有显著的意义，不同处理间的差异显著；R2为0.9593，表明因变量的取值有 95.93%来自于自变量，即萃取温度、萃取时间与解析时间。上述结果表明该模型能反映因变量的变化，拟合程度好[11]。得到回归方程：

主要因素间的交互作用如下图5所示。

所得的回归方程能较好的预测豆酱风味物质萃取随各参数的变化规律，可以利用该回归方程确定最佳萃取条件。由 Design Expert 8.0软件分析得到的最大因变量对应的固相微萃取最佳条件如下：萃取温度61.40℃，萃取时间40.99 min，解析时间 2 min，理论最大峰面积为9.05709E+006。为检验响应面法的可行性，采用得到的最佳萃取条件进行萃取的验证实验。考虑到实际操作，对萃取条件进行调整，得出最佳萃取条件为：萃取温度62℃，萃取时间 41 min，解析时间 2 min。经 3次平行实验得到的实际平均峰面积为8.45932E+006，与理论值相差6.60%。表明该模型有较高的适用性，该响应面方法对传统发酵豆酱挥发性物质萃取条件进行回归分析和参数优化也有较好的适用性[12]。

2.3 黑龙江省传统发酵豆酱风味物质检测

根据上述实验得到的最佳条件，应用PDMS/CARB/DVB固相微萃取头，萃取温度62℃，萃取时间41 min，解析时间2 min，检测黑龙江省传统发酵豆酱发酵1个月的挥发性风味物质成分及相对含量见表3。

由表3可得，经SPME吸附，GC-MS分析，共得到34个有效峰，与谱图库比对得到34种挥发性成分，包括烷烯烃类11种，酮类2种，醚类4种，醛类2种，芳香类化合物6种，酯类8种，杂环类化合物1种。由此可知，烷烯烃类、酯类和芳香类对黑龙江省传统发酵豆酱风味贡献最大，都具有果香、甜香和脂肪香的气味，让人产生食欲。

3结论

通过响应面试验所得的回归方程能较好的预测豆酱风味物质萃取随各参数的变化规律，可以利用该回归方程确定最佳提取条件。考虑到实际操作，对萃取条件进行调整，得出最佳萃取条件为：萃取温度62℃，萃取时间41 min，解析时间2 min。

表1 响应面试验设计

表2 回归方程方差分析

图5AC因素间的交互作用图

表3 传统发酵豆酱发酵1个月的风味物质

采用顶空固相微萃取与气质联用法，在发酵一个月的传统发酵豆酱样品中共鉴定出34种挥发性风味成分，这些成分包括酯类、醛类、酮类、醚类、烷烯烃类、酚类和杂环化合物等几类物质，可得出其主要风味物质为：11-二十三烯，苯甲醛，苯乙醛，2-壬酮，十甲基环五硅氧烷，4-甲氧基苯乙烯，萘，吲哚，2-甲基萘，3,4-二甲氧基苯乙烯，邻苯二甲酸二丁酯，油酸甲酯，10,13-十八碳二烯酸甲酯，(Z,Z)-9,12-十八烷二烯酸乙酯，这些可能为黑龙江省传统发酵豆酱的特征风味物质。

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Optimizing HS-SPME Extraction for Flavor Compounds of Traditional Fermented Soybean Paste by Response Surface Methodology

HanCuiping,TangHuijuan,ZhaoYue,WangZongying,ChengJianjun,TianBo,LiYang, XieFengying
（College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China）

The optimum extraction conditions for flavor compounds of traditional fermented soybean paste were established by head-space solid phase micro extraction（HS-SPME）in combination with response surface methodology at actual accepted conditions.The optimum extraction conditions were temperature of 62℃,extraction duration of 41.0 min and parsing duration of 2 min.Thirty-four volatile flavor ingredients including alkyl olefins,esters,aldehydes,ketones,and fragrant aromatic compounds were identified by HS-SPME to a one-month traditional fermented soybean paste samples.These ingredients contributed a lot to the flavor of traditional fermented soybean paste,and probably be the special flavor substances for the traditional fermented soybean paste in Heilongjiang province.

Traditional fermented soybean paste;Flavor compounds;HS-SPME;GC-MS;Response surface methodology

TS214.2

A

1674-3547(2015)06-0014-07

2015－09－29

韩翠萍，女，博士，教授，研究方向为粮食、油脂及植物蛋白工程

黑龙江省教育厅科学技术研究项目面上项目（12521018）