一磷酸腺苷(AMP)二钠改善猪肉嫩度的工艺优化*

邓少颖，王道营，孙冲，张牧焓，卞欢，吴海虹，诸永志，耿志明，刘芳，徐为民

1(江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京，210014)

2(南京农业大学，教育部肉品加工与质量控制重点实验室，江苏南京，210095)

猪肉的品质是由一系列的评价指标来评定，它包括食用品质、营养品质、技术品质、卫生品质和安全性等［1］。而消费者对肉制品的评价往往是从感官评价开始的，其中嫩度和蒸煮损失是感官评价最为重要的2个方面［2-5］。肉的嫩度一般分为基础硬度和肌动球蛋白硬度。基础硬度由结缔组织蛋白和其他基质蛋白决定，而肌动球蛋白硬度是由肌原纤维蛋白决定［6］，由于基础硬度不易改变，因此改变肌原纤维蛋白中含量较高的肌动蛋白和肌球蛋白2种蛋白质的结构和性质是改善嫩度的有效途径。

一磷酸腺苷(AMP)是脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)的组成成分，在生物体内几乎参与了所有的代谢过程，在细胞物质能量代谢和功能调节中起重要作用［7］。AMP也被运用到食品加工中，作为增味剂或是其他某些特殊用途［8］。Okitani等研究加热过程中嫩度的变化规律时发现，当嫩度相对较好时，有大量的肌动球蛋白发生解离［9］。Koohmaraie等推测宰后成熟过程中肌动球蛋白结构的弱化可能对于肉品嫩度的改善起到了重要作用［10］。董晗等研究也发现，AMP能够促进鸭肉中肌动球蛋白的解离，并有较好的嫩度改善［11］。AMP在AMP脱氨酶(AMPD)的作用下，降解成肌苷酸(IMP)和氨［12］，进而可能对肌动球蛋白的结构或性质产生影响。而AMP脱氨酶的活性受到多种因素的影响，比如盐，温度等，因此对AMP脱氨酶产生影响的因素亦可能对剪切力及蒸煮损失产生影响。

本实验拟研究AMP、盐浓度、温度对猪肉嫩度及蒸煮损失的影响，并利用响应面优化得到改善猪肉嫩度和蒸煮损失的最佳工艺参数。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

里脊肉，购自南京孝陵卫农贸市场，选自当地的土猪品种，猪肉刚宰杀后，立即取里脊肉，置于4℃冰箱中成熟10 h，待用。

AMP，美国Sigma公司;NaCl(分析纯)，巴傲得生物科技公司。

1.2 仪器与设备

M124A电子分析天平，意大利BEL公司;SPX-250B-Z生化培养箱，上海博讯有限公司;CENTER 309型数显温度计，台湾群特科技公司;HH-8型数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司;TVT-300XP质构仪，瑞典波通仪器公司。

1.3 实验方法

1.3.1 肉样处理

将选取的里脊肉修剪成形状为(6×5×1.5)cm、质量为(50±1)g的长方体肉块。

1.3.2 剪切力测定

剪切力测定方法参照文献［13-14］，稍作修改。测定整块肉样，每个样品重复测定3次。使用TVT-300XP质构仪，安装刀片式探头(Razor-Blade Shear)，刀头高为24.0 mm、宽为8.9 mm;参数设定如下:刺入深度为25 mm，触发力为50 g，测试速度为2 mm/s。测试后得到最大剪切力。

1.3.3 蒸煮损失测定

里脊肉称重后用蒸煮袋封好放入80℃水浴锅中，加热至肉中心温度为75℃，立即取出，冰浴冷却至肉中心温度为20℃，取出样品用滤纸吸干表面水分后称重。

蒸煮损失/%=［(煮前重-煮后重)/煮前重］×100

1.3.4 单因素实验

NaCl浓度对剪切力和蒸煮损失的影响:取18块修剪好的里脊肉块，随机的分成6组，置于5号自封袋中，分别加入50 mL浓度为0%、2%、4%、6%、8%、10%的NaCl溶液(其中NaCl溶液中溶解有20 mmol/L的AMP)于5℃的生化培养箱中腌制10 h后，测定剪切力和蒸煮损失。

AMP浓度对剪切力和蒸煮损失的影响:取18块修剪好的里脊肉块，随机的分成6组，置于5号自封袋中，分别加入 50 mL 浓度为 0、10、20、30、40、50 mmol/L的AMP溶液(AMP溶解于4%的NaCl溶液中)于5℃的生化培养箱中腌制10 h后，测定剪切力和蒸煮损失。

温度对剪切力和蒸煮损失的影响:取15块修剪好的里脊肉块，随机的分成5组，置于5号自封袋中，加入50 mL 20 mmol/L的AMP溶液(AMP溶解于4%的 NaCl溶液中)，分别于 5、10、15、20、25 ℃生化培养箱中腌制10 h后，测定剪切力和蒸煮损失。

1.3.5 响应面分析法优化改善猪肉嫩度及蒸煮损失的条件

根据单因素实验结果，结合Box-Behnken的中心组合实验设计原理，设计3因素3水平的响应面试验。以NaCl浓度(%)、AMP浓度(mmol/L)、温度(℃)为自变量，以剪切力及蒸煮损失为响应值进行响应面优化。其组合设计水平取值及编码见表1。每个实验进行3次重复，实验结果取平均值。

表1 Box-Behnken设计因素水平编码表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.6 数据统计分析

实验重复 3次，所得数据采用 Design-Expert 8.05b软件进行响应面实验设计和分析，用SPSS17.0软件进行数据处理。拟合二次多项式方程可以表达为:

式中Y是响应值(剪切力、蒸煮损失);Xi、Xj为自变量编码水平;b0为常数项;bi为线性回归系数;bii为二次项回归系数;bij为交互项回归系数。多项式模型方程拟合可靠性由R2表达，其统计学上的显著性由F值检验。影响因素的线性效应、平方效应及其交互效应的显著性由模型系数的P值、F值检验。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 NaCl浓度对剪切力和蒸煮损失的影响

由图1可以看出，剪切力和蒸煮损失均随着NaCl浓度的提高，先降低后升高，但两者的变化趋势不同。当NaCl浓度从0% ～4%，剪切力显著降低(P＜0.05)，再随着NaCl浓度的升高，剪切力显著升高，但6%，8%，10%处理组间无显著性差异，与2%处理组也无显著性差异(P＞0.05)。当NaCl浓度从0%～4%，蒸煮损失显著降低(P＜0.05)，再随着NaCl浓度的升高，蒸煮损失显著性升高(P＜0.05)。6%与8%NaCl浓度的处理组对蒸煮损失的影响无显著性差异(P＞0.05)，8%与10%NaCl浓度的处理组对蒸煮损失的影响无显著性差异(P＞0.05)。有研究表明，NaCl对AMP脱氨酶的活性会产生抑制性的影响［15］，因此可能有大量AMP未被降解，从而进入到细胞中的AMP浓度相对较高，进而作用于肌原纤维蛋白，使得嫩度得到改善。但随着NaCl浓度的升高，肉的嫩度变差，可能是高浓度的盐含量使得某些蛋白质变性及水分含量减少。因此，综合剪切力、蒸煮损失考虑，选取NaCl浓度为4%。

图1 不同NaCl浓度对猪肉剪切力及蒸煮损失的影响Fig.1 Effect of NaCl concentration on shear force and cooking loss of pork

2.1.2 AMP浓度对剪切力和蒸煮损失的影响

由图2可以看出，剪切力和蒸煮损失均随着AMP浓度的提高而降低。AMP浓度从0～20 mmol/L，剪切力和蒸煮损失均显著性降低(P＜0.05)，而后AMP浓度从20～40 mmol/L，剪切力降低不显著(P＞0.05)，50 mmol AMP处理组除了与40 mmol/L处理组无显著性差异外(P＞0.05)，与其他处理组都有显著性差异(P＜0.05)。AMP浓度从30～50 mmol/L，蒸煮损失显著性降低(P＜0.05)，而20 mmol/L与30 mmol/L处理组对蒸煮损失的影响无显著性差异(P ＞0.05)。Okitani［16］等研究发现从鸡、牛、猪骨骼中提取的肌动球蛋白溶液，经AMP孵育后，肌动球蛋白发生了大量的解离。Koohmaraie［10］等推测宰后成熟过程中肌动球蛋白结构的弱化可能对于肉品嫩度的改善起到了重要作用。因此，当较高浓度的AMP进入到细胞内，可能作用于肌动球蛋白使之发生解离，破坏了肌原纤维蛋白骨架的完整结构，从而改善肉的嫩度。经AMP处理后的猪肉有相对较高的pH值，并且AMP有助于抑制肌肉收缩，从而使得肌原纤维内的水分含量增加。因此，综合剪切力、蒸煮损失，及考虑到成本费用的增加，选取AMP浓度为20 mmol/L。

图2 不同AMP浓度对猪肉剪切力及蒸煮损失的影响Fig.2 Effect of AMP concentration on shear force and cooking loss of pork

2.1.3 温度对剪切力和蒸煮损失的影响

由图3可以看出，剪切力和蒸煮损失均随着温度的升高，先降低后升高。不同温度对剪切力和蒸煮损失都有相似的变化趋势。温度在5～15℃内，剪切力和蒸煮损失均显著性降低(P＜0.05);再随着温度的升高，剪切力和蒸煮损失均显著性升高(P＜0.05)，但20和25℃处理组间的剪切力和蒸煮损失均无显著性差异(P＞0.05)。随着温度的升高，有利于AMP进入到细胞中发挥作用，但较高的温度会促进AMP脱氨酶的活性，可能使得AMP在未进入细胞内时就降解成IMP，减弱AMP对肌原纤维蛋白的作用。因此，综合剪切力、蒸煮损失考虑，选取温度为15℃。

图3 不同温度对猪肉剪切力及蒸煮损失的影响Fig.3 Effect of temperature on shear force and cooking loss of pork

2.2 响应面优化实验结果与分析

2.2.1 响应面模型拟合及方差分析

在单因素实验的基础上，确定NaCl浓度为4%、AMP浓度为20 mmol/L、温度为15℃作为自变量，按照BBD方法设计实验，以猪肉的剪切力和蒸煮损失作为响应值进行响应面优化实验，得到的结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Experimental design and results for response surface methodology

利用Design Expert 8.0软件对试验结果进行二次多元回归拟合，得到以剪切力(Y1)和蒸煮损失(Y2)为目标函数的二次多元回归方程分别为:

对得到的回归模型式(1)进行方差分析，由表3可知，该模型的P＜0.000 1，表明该模型达到极显著水平，又因其失拟项不显著(P=0.735 5＞0.05)，表明该模型与数据得到很好的拟合，未知因素对本实验的结果干扰很小［17-18］。模型的决定系数R2=0.997 8，说明该拟合模型方程与实际情况相符，能较好的反映NaCl浓度、AMP浓度和温度与猪肉嫩度改善之间的关系［19-21］。采用F检验来判定回归方程中各自变量对腌制后猪肉嫩度影响的显著性，同时变量概率P值越小，其影响越显著［22］。由表3回归方程系数显著性检验可知，X1项、X2项、X1X2项、X12项、X22项、X32对响应值有着极显著的影响(P＜0.01)，X3项对响应值有着显著的影响(P＜0.05)，X1X3项、X2X3项对响应值的影响不显著(P＞0.05)。三因素对剪切力的影响顺序为:X2＞X1＞X3，即 AMP浓度＞NaCl浓度＞温度。

表3 回归方程各项方差分析Table 3 Regression equation of the analysis of variance

对得到的回归模型式(2)进行方差分析，由表4可知，该模型的P＜0.000 1，表明该模型达到极显著水平，又因其失拟项不显著(P=0.621 6＞0.05)，表明该模型与数据得到很好的拟合，未知因素对本实验的结果干扰很小。模型的决定系数R2=0.998 2，说明该拟合模型方程与实际情况相符，能较好的反映NaCl浓度、AMP浓度和温度与蒸煮损失之间的关系。由表4回归方程系数显著性检验可知，X1项、X2项、X3项、X1X2项、X12项、X22项、X32对响应值有着极显著的影响(P＜0.01)，X2X3项对响应值有着显著的影响(P＜0.05)，X1X3项对响应值的影响不显著(P＞0.05)。三因素对剪切力的影响顺序为顺序为:X2＞X1＞X3，即AMP浓度＞NaCl浓度＞温度。

表4 回归方程各项方差分析Table 4 Regression equation of the analysis of variance

2.2.2 响应面交互作用分析与显著因素最佳值的确定

图4直观地给出了NaCl浓度、AMP浓度、温度之间交互作用对剪切力影响的响应面3D和等高线图。从图4中的最低点和等值线可以看出，在所选的水平范围内存在极值，即为响应面上的最低点，同时也是等高线图中最小椭圆的中心点［23］。图4-a是NaCl浓度和AMP浓度交互作用对剪切力影响的三维图。当温度固定为15℃时，随着AMP浓度的增加，剪切力值越来越小，曲面较陡;而随着NaCl浓度的升高，剪切力先降低后升高。图4-b NaCl浓度和AMP浓度交互作用的等高线图呈椭圆形，表明两因素有显著的交互作用。表3也表明 NaCl浓度和AMP浓度及两者之间交互作用对剪切力的变化有着极显著的影响。图4-c是NaCl浓度和温度交互作用对剪切力影响的三维图。当AMP浓度固定为20 mmol时，随着NaCl浓度和温度的升高，剪切力先降低后升高，曲面呈钟形。由图4-d的等高线图可知，NaCl浓度和温度交互作用对剪切力影响不显著，AMP浓度对剪切力有着极显著的影响，与表3结论相同。图4-e是AMP浓度和温度交互作用对剪切力影响的三维图。当NaCl浓度固定为4%时，随着AMP浓度的升高，剪切力降低较大，曲面较陡，而随着温度的升高，剪切力先降低后升高，变化趋势较缓，曲面较平缓。由图4-f的等高线图可知，AMP浓度和温度交互作用对剪切力影响不显著。由SAS优化程序分析剪切力相对较低时参数为NaCl浓度为4.15%，AMP浓度为 22.65 mmol/L，温度为 16.70℃，剪切力可以达到621.769 g。

图4 NaCl浓度、AMP浓度及温度对猪肉剪切力影响的响应面与等高线图Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of NaCl concentration，AMP concentration and temperature on shear force of pork

图5直观地给出了NaCl浓度、AMP浓度、温度之间交互作用对蒸煮损失影响的响应面3D和等高线图。从图5中的最低点和等值线可以看出，在所选的水平范围内存在极值，即为响应面上的最低点，同时也是等高线图中最小椭圆的中心点。图5-a是NaCl浓度和AMP浓度交互作用对蒸煮损失影响的三维图。当温度固定为15℃时，随着AMP浓度的增加，蒸煮损失降低较大，曲面较陡;而随着NaCl浓度的升高，蒸煮损失先降低后升高，曲面较陡。由图5-b等高线图可知NaCl浓度和AMP浓度交互作用对蒸煮损失有显著的影响。而表3也表明，NaCl浓度和AMP浓度及两者之间交互作用对蒸煮损失的变化有着极显著的影响。图5-c是NaCl浓度和温度交互作用对蒸煮损失影响的三维图。当AMP浓度固定为20 mmol/L时，随着NaCl浓度和温度的升高，剪切力先降低后升高，但曲面变化较缓，曲面呈钟形。由图5-d的等高线图可知NaCl浓度和温度交互作用对蒸煮损失影响不显著，AMP浓度对蒸煮损失有着极显著影响，与表3结论相同。图5-e是AMP浓度和温度交互作用对蒸煮损失影响的三维图。当NaCl浓度固定为4%时，随着AMP浓度的升高，蒸煮损失降低较快，曲面较陡，而随着温度的升高，剪切力先降低后升高，变化趋势较大，曲面较陡。由图5-f等高线图可知，AMP浓度和温度交互作用对蒸煮损失影响显著。由SAS优化程序分析蒸煮损失相对较低时参数为NaCl浓度为4.05%，AMP浓度为22.27 mmol/L，温度为16.56℃，蒸煮损失可以达到7.801 86%。

图5 NaCl浓度、AMP浓度及温度对猪肉蒸煮损失影响的响应面与等高线图Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of NaCl concentration，AMP concentration and temperature on cooking loss of pork

2.2.3 验证实验

根据剪切力和蒸煮损失最优化的参数，结合实际操作与降低成本的考虑，选取的参数为:NaCl浓度4.15%，AMP浓度22.27 mmol/L，温度16.70℃。在此基础上进行3次验证实验，猪肉的剪切力的平均值为625.281 g，与理论预测值的相对误差为0.562%;蒸煮损失的平均值为8.074 38%，与理论预测值的相对误差为3.375%。说明应用响应面法对改善猪肉嫩度的参数优化准确可靠，具有实际可操作性。

3 结论

在单因素实验的基础上，采用响应面法对影响猪肉嫩度的因素进行优化设计，得到各因素对猪肉嫩度影响作用的关系为X2＞X1＞X3，即AMP浓度＞NaCl浓度＞温度。得到的2个回归模型极显著，对实验拟合程度较高，能够较好地分析和预测各因素对猪肉腌制效果的影响。因此依据模型和实际操作确定最佳腌制条件为:NaCl浓度4.15%，AMP浓度22.27 mmol/L，温度16.70℃，此条件下得到的剪切力为625.281 g，蒸煮损失为8.074 38%，与响应面模型所预测的剪切力621.769 g及蒸煮损失7.801 86%十分接近，表明响应面分析法优化影响猪肉嫩度的条件是准确可靠，具有较好的应用价值。

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