结直肠中组蛋白去乙酰化酶的表达及意义

结直肠中组蛋白去乙酰化酶的表达及意义

谢权彭勃张罡哪仁

(海口市人民医院中南大学湘雅医学院附属海口医院胃肠外科病理科,海南海口570208)

摘要〔〕目的探讨组蛋白去乙酰化酶(HDAC1)在结直肠癌中的表达并分析其临床意义。方法免疫组织化学法检测89例结直肠癌组织、89例癌旁组织、32例正常结/直肠组织和21例腺瘤组织中HDAC1表达情况，统计学分析HDAC1染色强度与临床病理特征关系。结果癌组织、癌旁组织、腺瘤组织和正常结/直肠组织中HDAC1表达强阳性率分别为73.0%(65/89)、56.2%(50/89)、66.7%(14/21)和40.6%(13/32)；HDAC1表达与患者Dukes分期、组织学分型和淋巴结转移相关，与患者性别、年龄及肿瘤的大小无关。Dukes A～B分期HDAC1强阳性表达率明显低于Dukes C～D分期(χ2=5.939,P=0.031)。低、未分化组HDAC1强阳性表达率显著高于高、中分化腺癌(χ2=18.692,P=0.036)。有淋巴结转移患者HDAC1强阳性表达率显著高于无淋巴结转移组(χ2=21.025,P=0.030)。结论HDAC1高表达与结直肠癌患者临床病理学特征相关。免疫组化方法检测HDAC1在结直肠癌中的表达，有可能成为预测结直肠癌患者对HDAC抑制剂治疗反应的新手段。

关键词〔〕结直肠癌；组蛋白去乙酰化酶；免疫组织化学

中图分类号〔〕R735.3〔文献标识码〕A〔

第一作者：谢权(1956-)，男，副主任医师，主要从事结直肠外科基础与临床研究。

研究〔1〕认为多数肿瘤对组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂(HDACi )敏感。HDACi被用于各种肿瘤的临床试验，而基于淋巴瘤的研究认为HDAC1蛋白表达可能是肿瘤对HDACi敏感的重要因素〔2〕。HDAC1特异干扰RNA能有效诱导大肠癌细胞发生凋亡和细胞周期阻滞，从而抑制细胞的增殖〔3〕。HDAC1是否与结直肠癌发生发展相关，目前尚未见报道。本研究旨在探讨结直肠中HDAC1的表达及临床意义。

1材料与方法

1.1对象随机选取2009～2011年海口市人民医院胃肠外科行结直肠癌根治手术切除的癌组织标本89例、癌旁组织(癌组织边缘4 cm)标本89例、正常结/直肠组织标本32例和腺瘤组织标本21例。89例癌组织标本中，男58例，女31例，平均年龄(51±12.5)岁。依据2006年世界卫生组织(WHO)分类法进行临床病理特征分类。Dukes分期：A期15例、B期24例、C期40例、D期10例。组织学分型：高分化腺癌12例、中分化腺癌40例、低分化癌26、未分化腺癌11例。有淋巴结转移患者35例、无淋巴结转移患者54例。所有患者在行手术前均未进行过放、化疗。所选标本均经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片。

1.2方法及试剂免疫组化采用链霉菌蛋白-过氧化物复合物(SP)法，染色步骤按试剂盒操作说明进行。HDAC1多克隆抗体为上海吉泰生物科技有限公司产品；二抗、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒为福州迈新生物技术开发有限公司产品。

1.3结果判定HDAC1阳性染色为位于细胞质或细胞核的棕黄色颗粒。采用双盲法随机选取10个高倍视野(400 倍)，每个高倍视野下计数100个肿瘤细胞。观察阳性细胞所占的百分数及染色强度。对阳性细胞所占的百分数计分(< 5%=0，5%～25%=1，26%～50%=2，51%～75%=3，>75=4)及染色强度(无色=0，淡黄色=1，棕黄色=2，深棕色=3)进行评分，累积0分为(-)，1～2分为(+)，3～4分为()，5～7分为()。将“-～+”定义为蛋白低表达，“～”定义为蛋白高表达。

1.4统计学方法应用SPSS15.0软件进行χ2检验。

2结果

2.1HDAC1在不同组织中的表达在不同结直肠组织中，HDAC1主要表达于胞核。癌组织中HDAC1高表达率，与癌旁组织中比较差异显著(P<0.05)；腺瘤组织与正常组织比较差异无统计学意义(P>0.05)；同时，正常组织与癌组织两者比较差异显著(χ2=0.842,P<0.05)。见图1，表1。

图1　HDAC1在结肠癌组织细胞中的表达(×200)

2.2HDAC1表达与患者临床特征的关系HDAC1表达与患者性别、年龄及肿瘤的大小无关。见表2。

2.3HDAC1表达与患者临床病理特征的关系在结直肠癌Dukes分期中Dukes A、B、C、D期HDAC1高表达率呈随级增加趋势；A～B期HDAC1高表达率显著低于C～D期(P<0.05)。在结直肠癌组织学分型中高、中、低、未分化腺癌随着组织学分型级别降低HDAC1强阳性表达率增高；低、未分化组HDAC1高表达率显著高于高、中分化腺癌(P<0.05)。有淋巴结转移结直肠癌HDAC1高表达率(30/35)显著高于无淋巴结转移组(P<0.05)。见表3。

表1　HDAC1在不同组织中的表达

表2　HDAC1表达与患者临床特征的关系

表3　HDAC1蛋白表达与患者临床病理特征的关系

3讨论

HDAC1是1996年由美国哈佛大学Taunton实验室发现的第一个哺乳动物的HDAC，基因全长约41 kb，蛋白由482个氨基酸组成，相对分子量约55 kD〔4〕。HDAC1与HDAC2、HDAC3和HDAC8共属于I类组蛋白去乙酰化酶。该类酶与酵母转录调控因子RPD3和多核配合物亚基具有高度同源性，在亚细胞定位、多亚基复合物的联系及蛋白翻译后修饰(PTMs)中具有重要作用。目前已证实，HDAC1通过调节组蛋白和非组蛋白的蛋白质去乙酰化参与细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡调控，可能是哺乳动物基因转录的关键调节子〔5〕。HDAC1可通过调节细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21表达实现细胞周期的调控，例如宫颈癌Hela细胞〔6〕。HDAC1基因敲除小鼠，胚胎细胞增殖能力比对照明显减弱〔7〕。HDAC1的表达可能与多种肿瘤如胃癌、乳腺癌、肺癌和结直肠癌等的进展有关。HDAC1高表达明显增加肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力，且其表达水平受调节细胞周期、分化和增殖的转录因子和高细胞密度的影响〔5〕。该基因的失活也影响细胞增殖和凋亡过程相关基因的转录。在多数人肿瘤细胞株的研究中发现，HDAC1基因的缺失将导致有丝分裂细胞的丢失和细胞死亡数量的增加〔8〕。Senese等〔9〕发现人肿瘤细胞缺乏HDAC1将不能进行有丝分裂，细胞周期停滞在G1期或G2/M过渡期，抑制肿瘤细胞生长，同时使细胞通过半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3激活途径发生凋亡。HDAC1 siRNA可下调固期蛋白A(Cyclin A)的表达，抑制卵巢癌细胞的增殖〔10〕。张孟贤等〔3〕研究也发现，通过RNA干扰沉默大肠癌细胞系SW480 HDAC1基因，细胞发生G0/G1和G2/M期阻滞，并伴随着明显的细胞凋亡，且该过程可能与上调p21/WAF-1/CIP-1的表达抑制Cdk2与Cyclin E的表达有关。HDACi已被证实对多数基因的表达调控具有重要影响，特别是抑癌基因，HDACi能上调抑癌基因(如p21/WAF-1/CIP-1)表达，从而影响其他基因(如血管生长因子)表达，发挥抗肿瘤作用〔6〕。研究〔11〕证明HDACi CG200745和CG006能通过调节肿瘤细胞中p53的乙酰化导致肿瘤细胞周期停滞、分化和凋亡。联合应用HDACi和DNMT1抑制剂可恢复乳腺癌细胞对内分泌治疗的敏感性〔12,13〕。除此之外，HDACi还具有抗炎、抗机体免疫的作用〔1〕。通过RT-PCR和免疫组织化学研究发现77%的胃癌患者组织HDAC1高表达，并认为HDAC1在胃癌的预后中具有重要的价值〔14〕。然而，目前有关HDAC1与结直肠癌临床意义的研究还没有直接的报道。HDAC1在肿瘤发生发展的作用机制目前还不明确，虽然通过免疫组化证实HDAC1与结直肠癌的临床病理特征相关，但还需采取其他研究手段(如：WB和RT-PCR)。此外，还需进一步扩大单组样本量。

4参考文献

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2Leclerc GJ,Mou C,Leclerc GM,etal.Histone deacetylase inhibitors induce FPGS mRNA expression and intracellular accumulation of long-chain methotrexate polyglutamates in childhood acute lymphoblastic leukemia:implications for combination therapy〔J〕.Leukemia,2010；24(3):552-62.

3张孟贤,韩娜,于世英.RNA干扰沉默HDAC1基因对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响〔J〕.世界华人消化杂志，2008；16(11)：1173-8.

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8Dangond F,Henriksson M,Zardo G,etal.Differential expression of class I HDACs:roles of cell density and cell cycle〔J〕.Int J Oncol,2001；19(4):773-7.

9Senese S，Zaragoza K，Minardi S，etal.Role for histone deacetylase 1 in human tumor cell proliferation〔J〕.Mol Cell Biol,2007；27(13):4784-95.

10Hayashi A,Horiuchi A,Kikuchi N,etal.Type-specific roles of histone deacetylase(HDAC) overexpression in ovarian carcinoma:HDAC1 enhances cell proliferation and HDAC3 stimulates cell migration with downregulation of E-cadherin〔J〕.Int J Cancer,2010；127(6):1332-46.

11Zupkovitz G,Grausenburger R,Brunmeir R,etal.The cyclin-dependent kinase inhibitor p21 is a crucial target for histone deacetylase 1 as a regulator of cellular proliferation〔J〕.Mol Cell Biol,2010；30(5):1171-81.

12Chai G,Li L,Zhou W,etal.HDAC inhibitors act with 5-aza-2'-deoxycytidine to inhibit cell proliferation by suppressing removal of incorporated abases in lung cancer cells〔J〕.PLoS One,2008；3(6):e2445.

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14Sudo T,Mimori K,Nishida N,etal.Histone deacetylase 1 expression in gastric cancer〔J〕.Oncol Rep,2011；26(4):777-82.

〔2014-12-07修回〕

(编辑袁左鸣)