甘草提取物对氧化应激损伤黑素细胞的影响

甘草提取物对氧化应激损伤黑素细胞的影响

黎雯

(海南省皮肤性病防治中心皮肤外科，海南海口570206)

摘要〔〕目的探讨甘草提取物对体外培养黑素细胞氧化应激的影响。方法从正常人包皮分离培养黑素细胞，用甘草提取物处理培养的黑素细胞，处于过氧化氢培养基中。结果过氧化氢组黑素细胞活力显著下降(P<0.05)；甘草提取物组黑素细胞活力浓度依赖性地有所提高(P<0.05)。结论甘草提取物可抑制黑素细胞，控制氧化应激反应。

关键词〔〕黑素细胞；甘草提取物

中图分类号〔〕R285〔文献标识码〕A〔

第一作者：黎雯(1974-)，女，主治医师，主要从事变态反应研究。

中医认为甘草，具有补脾益气，祛痰止咳，缓急止痛，清热解毒，调和诸药的功效。西医研究发现甘草具有抗炎、抗变态反应、抗氧化、杀菌和美白的作用〔1〕。甘草的化学组成极为复杂，主要成分为甘草甜素和甘草次酸。近年来，研究发现甘草有抗氧化的作用，为进一步研究甘草对人表皮黑素细胞的调控作用〔1〕。我们首先体外分离、培养人正常人表皮黑素细胞〔2〕，建立黑素细胞氧化应激模型，并观察黑素细胞增殖情况，以探讨其可能的作用机制。

1材料和方法

1.1实验药品甘草提取物购于中国药品生物制品检定所。使用前，先用DMSO溶解，配成母液(浓度100 g/L)，放置于-20℃冰箱低温保存。实验过程中用新鲜培养基调至终浓度。

1.2主要试剂的配制M254培养基(美国Cascade公司)；MTS(美国Promega公司)；青霉素-链霉素双抗溶液(美国Gibco公司)；DMSO(美国Sigma公司)人黑素细胞生长添加剂HMGS(美国Cascade公司)；0.25% EDTA胰蛋白酶(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；Dispase分离酶(美国罗氏试剂公司)。

1.3细胞来源实验中所需细胞取至正常青年男性包皮术后留下的病理组织，实验前，应征求患者本人同意，同意后方可进行实验，符合伦理学要求。

1.4实验方法

1.4.1实验分组实验中共设立5个分组，空白对照组为完全培养基，添加黑色素培养；过氧化氢组中为过氧化氢培养基，浓度保持在0.4 mmol/L；甘草提取物组中为甘草提取物培养基，保持浓度为10-8mol/L，每组在培养过程中保留复孔4个；实验组中再次分为3组，加入2.5 mg/L 5.0 mg/L及10.0 mg/L甘草提取液组，随后将3个甘草提取物组分别添加至过氧化氢培养基，培养基浓度保持在0.4 mmol/L。

1.4.2分离人表皮黑素细胞首先将正常青少年男性包皮组织置于75%的酒精溶液中浸泡约10 min，然后用PBS缓冲液冲洗包皮组织6～10遍〔3〕；再使用眼科剪剔除组织皮下脂肪组织，并再次用PBS液冲洗5～6次。将组织剪1.5 mm×1.5 mm的方形组织块，平铺在培养皿中(真皮朝向培养皿底部)；组织中加入Dispase分离酶3～5 ml，放入4℃冰箱中16 h，后转移入恒温培养箱孵育1 h；用眼科剪剔除真皮，留下表皮。使用PBS冲洗组织2～3次，室温下0.25%胰蛋白酶消化5 min，随后加入10% FBS终止消化，吹打组织，制成黑素细胞悬液，随后用200目细胞筛过滤，并低速离心(1 200 r/min)3 min，随后记录细胞数量，在无菌培养瓶中，浓度保持在5×104/ml左右，培养瓶中均加入4 ml M254，处于二氧化碳的环境中恒温培养，温度保持在37℃左右。培养2 d，更换培养液，以后每隔2～3 d换液1次，方法同文献〔3〕。

1.4.3人表皮黑素细胞的鉴定(L-DOPA染色法)取第三代人表皮黑素细胞，与1 ml的胰蛋白酶充分混合，浓度为0.25%。暂停消化过程，使黑素细胞保持在1×104/ml，接种于6孔培养板中，然后置于二氧化碳恒温培养箱中培养48 h。随后加入已预热至37℃的4%多聚甲醛固定细胞25 min，然后双蒸水洗3次。将细胞盖玻片置于L-DOPA染色液中，严格检测染色情况，每半小时检测一次，3 h染色完成，得到棕色样品，进行漂洗脱水处理，封装成片。

1.4.4建立人表皮黑素细胞氧化应激模型在黑素细胞停留在对数生长时期，取出样品进行实验，使用PBS液进行清洗，待清洗干净后，与1 ml胰蛋白酶均匀混合，胰蛋白酶浓度为0.25%为宜，将混合液置于常温中3 min，取混合液中悬液，使浓度保持在2.5×105/ml，取96孔培养板，于上进行实验培养，37℃恒温状态。在5%CO2的环境中进行24 h的培养，观察细胞均附于细胞壁上后，将其与培养基分离，从复孔中对甘草提取物组中添加不同浓度的甘草提取物(2.5、5.0、10.0 mg/L)100 μl。其余组仅予以完全培养基环境，在恒温二氧化碳的条件下进行培养24 h，对黑素细胞的形态学改变做出记录比较，进行染色，原环境下延续4 h培养结束。MTS法检测各组细胞活力。

1.5统计学方法采用SPSS19.0软件进行方差分析。

2结果

2.1人表皮黑素细胞鉴定结果(L-DOPA染色法)染色后，可见样本呈黑色或棕褐色，说明反应呈阳性，验证为黑素细胞。见图1。

2.2甘草提取物对过氧化氢诱导下人表皮黑素细胞活力的影响(MTS法)过氧化氢组的黑素细胞活力降低显著较空白对照组明显降低〔(44.348±1.052)% vs (97.775±0.445)%，P<0.05〕，2.5、5.0、10、0 mg/L甘草提取物分别提高一定程度的黑素细胞活力〔(45.079±1.380)%、(47.891±1.466)%、(57.496±2.419)%，P<0.05〕，但仍低于空白对照组(P<0.05)。

图1　L-DOPA染色阳性人表皮黑素细胞(×200)

3讨论

甘草的化学组成极为复杂，目前为止从甘草中分离出的化合物有甘草甜素、甘草次酸、甘草甙、异甘草甙、新甘草甙等数十种化合物，但其中的主要成分为甘草甜素和甘草次酸。中医学认为，甘草味甘，性平，具有解毒清热，补气健脾的功效，现代医学认为，甘草可对咳嗽、口腔溃疡和胃溃疡有明显的治疗作用。近来有研究发现甘草有抑制黑素细胞酪氨酸酶和黑素瘤细胞黑素合成的作用。黑素细胞由神经嵴发出，共经过3发育阶段成型。胚胎发育期，在家族整合素的影响下，所有细胞均处在迁徙过程中，胚胎细胞在次过程中可直接发育成黑素细胞，并自动找寻生长位置〔4〕。生活中，一些皮肤炎症可造成黑素细胞大量沉积，从而导致晒伤和雀斑等〔5〕。黑素细胞的集聚和迁徙，与炎症的消退、切口的愈合和肿瘤细胞的扩散有直接联系，对患者病情的发展产生直接的影响〔6〕。

氧化应激反应在适当的强度下可对机体有促进作用，若超过适当的范围发生氧化应激反应，则可导致机体细胞大量死亡，对机体造成严重的额损伤。活性氧(ROS)可评定机体内的氧化应激程度。过氧化氢可提高ROS，当机体内的ROS量较高时，则认为大量细胞与蛋白质超负荷运转而死亡。本研究发现甘草提取物一定程度上剂量依赖性提高黑素细胞的活力，我们将在今后的试验中扩大甘草提取物浓度范围，以全面、系统地分析其对黑素细胞调控作用。Liu等〔7〕通过实验探究保护黑素细胞的过程中发现，若使用黄芩黄素对黑素细胞处理后，进行过氧化氢处理，随后观察ROS，发现ROS水平普遍升高，且黄芩黄素的浓度越高，ROS水平越低，对我们实验的结果进行了充分验证。

本实验说明，甘草提取物可提高机体内的ROS，对氧化应激反应的程度进行调控，进而影响细胞的死亡情况。由此可猜测甘草提取物是一种机体自身产生的保护氧化应激反应的物质。但目前对反应机制以及过程未能了解清楚，希望以后可进行相关实验，探究甘草提取物的作用机制以及调控氧化应激反应的原理，为化妆品及药物的研发提供更多的理论依据。

4参考文献

1Vaya J，Belinky PA，Aviram M.Antioxidant constituents from licorice roots：isolation，structure elucidation and antioxi dative capacity toward LDL oxidation〔J〕.Free Radical Biol Med，1997；23(3):302-13.

2Yokota T，Nishio H，Kubota Y，etal.The inhibitory effect of abridin from licorice extracts oll melanogenesis and inflammation〔J〕.Pigment Cell Res,1998;11(6)：355-61.

3张迪敏，洪为松，傅丽芳，等.个体化培养自体黑素细胞移植治疗白癜风〔J〕.中华皮肤科杂志，2010;43(10)：721-5.

4Kammerer R，Kleist SV.The carcinoembryonic antigen(CEA)modulates effect or target cell interaction by binding activated lymphocytes〔J〕.Int J Cancer，1996;68(4)：457-63.

5Komuro H，Rakic P.Intracellular Ca2+fluctuations modulate the rate neuronal migration〔J〕.Neuron，1996;17(2)：275-85.

6Aguino A，Formica V，Preto SP,etal.Drug-induced increase of carcinoembryonic antigen expression in cancer cells〔J〕.Pharmacol Res，2004;49(5)：383-96.

7Liu B，Jian Z，Li Q，etal.Baicalein protects human melanocytes from H2O2-induced apoptosis via inhibiting mitochondria-dependent caspase activation and the p38 MAPK pathway〔J〕.Free Radic Biol Med，2012;53(2)：183-93.

〔2013-12-18修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)