中枢nesfatin-1表达下调对SD大鼠胰岛素信号通路的影响

中枢nesfatin-1表达下调对SD大鼠胰岛素信号通路的影响

瞿文娟曾梦1李志勇程昌琴杨若梅蒋先淑杨刚毅1李伶2

(重庆医科大学附属永川医院内分泌科，重庆402160)

摘要〔〕目的探讨中枢nesfatin-1表达下调对SD大鼠肝胰岛素信号通路的影响。方法将雄性SD大鼠随机分为普食喂养+人工脑脊液(aCSF)输注组(NCA组，n=10)，普食喂养+ Ad-shGFP输注组(NCG 组，n=10)，普食喂养+ Ad-shNUCB2输注组(NCN组，n=10)，高脂喂养+人工脑脊液(aCSF)输注组(HFA组，n=10)，高脂喂养+Ad-shGFP输注组(HFG组，n=10)，高脂喂养+ Ad-shNUCB2 输注组(HFN组，n=10)。构建第三脑室微量输注系统进行第三脑室干预，留取普食组大鼠下丘脑、肝脏、脂肪和肌肉组织采用Western印迹测定 nesfatin-1表达。采用Western印迹法测定各组大鼠G6Pase及PEPCK的表达水平以和IR、IRS-1、AKT、STAT3及mTOR的蛋白磷酸化水平变化。结果和NCA或NCG组分别相比，NCN组下丘脑nesfatin-1表达显著降低(P<0.05)，而外周组织(肝、脂肪及肌肉)nesfatin-1表达无显著差异。和NCA组相比，HFA组的G6Pase、PEPCK表达水平均显著增高，而 IR、IRS-1、AKT、STAT3、mTOR的蛋白磷酸化水平均显著降低(P<0.05)。和NCA或NCG 组相比，NCN组的G6Pase、PEPCK表达水平均显著增高，而IR、IRS-1、AKT、 STAT3、mTOR的蛋白磷酸化水平均显著降低(P<0.05)。和HFA或HFG 组相比，HFN组的G6Pase、PEPCK表达水平均显著增高，而IR、IRS-1、AKT、STAT3、mTOR的蛋白磷酸化水平均显著降低(P<0.05)。结论中枢Ad-shNUCB2输注可下调SD大鼠下丘脑 nesfatin-1表达，同时下调机体肝胰岛素信号通路级联反应蛋白水平，可能通过抑制mTOR/STAT3信号通路从而降低机体肝脏糖异生。

关键词〔〕Nesfatin-1；脑室内输注；胰岛素信号通路；肝糖异生

中图分类号〔〕R589.1〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学

通讯作者：李志勇(1968-)，男，主任医师，硕士生导师，主要从事胰岛素抵抗、糖脂代谢研究。

1重庆医科大学附属第二医院内分泌科

2重庆医科大学检验系临床生化教研室和教育部实验诊断重点实验室

第一作者：瞿文娟(1982-)，女，在读硕士，医师，主要从事糖尿病方面的研究。

Effects of central nesfatin-1 knockdown on hepatic insulin signaling pathway

QU Wen-Juan, ZENG Meng, LI Zhi-Yong，etal.

Department of Endocrinology, Yongchuan Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 402160, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of central nesfatin-1 knockdown on hepatic insulin signaling pathway.MethodsMale Sprague-Dawley(SD) rats were randomly divided into normal-chow die (NCD) + aCSF (NCA, n=10), NCD + Ad-shGFP(NCG, n=10), NCD + Ad-shNUCB2 (NCN, n=10), high-fat diet (HFD) + aCSF(HFA, n=10), HFD + Ad-shGFP(HFG, n=10), HFD + Ad-shNUCB2 groups (HFN, n=10). After central intervention, NCD-fed rats were sacrificed and the expressions of nesfatin-1 in hypothalamic and peripheral tissues were examined. Other rats were sacrificed and the tissues were quickly taken away. The phosphorylated protein levels of IR, IRS-1, AKT, STAT3 and mTOR, and the protein levels of G6Pase, PEPCK were evaluated by Western blot.ResultsAfter central Ad-shNUCB2 intervention, hypothalamic nesfatin-1 protein levels was significantly decreased by 66% compared with rats that were given ACF or Ad-shGFP(P<0.05). However, no significant differences were found in nesfatin-1 expression in liver, muscle and adipose tissues. Compared with those of NCA group, the protein levels of G6Pase and PEPCK in HFA group were increased significantly (P<0.05). However, the phosphorylated protein levels of IR, IRS-1, AKT, STAT3 and mTOR inHFA group were decreased obviously(P<0.05). Compared with those of NCA or NCG groups, the protein levels of G6Pase and PEPCK in NCN group were increased significantly (P<0.05). However, the phosphorylated protein levels of IR, IRS-1, AKT, STAT3 and mTOR in NCN group were markedly decreased (P<0.05). Compared with HFA or HFG groups, the levels of G6Pase and PEPCK in HFN group were increased significantly (P<0.05). However, the phosphorylated protein levels of IR, IRS-1, AKT, STAT3 and mTOR in HFN group were decreased significantly (P<0.05).ConclusionsCentral Ad-shNUCB2 intervention could decrease hypothalamic nesfatin-1 protein levels significantly. Knockdown of central nesfatin-1 could decrease the phosphorylation of several proteins in insulin signaling cascade. Moreover, central nesfatin-1 knockdown could lighten insulin sensitivity through inhibition of mTOR-STAT3 signaling pathway.

【Key words】Nesfatin-1；Intracerebroventricular infusion；Insulin signaling pathway；Hepatic gluconeogenesis

Nesfatin-1是一种新发现的下丘脑抑制摄食因子〔1〕，广泛表达于下丘脑各核团，在机体其他组织如胰腺组织、脑垂体、睾丸中均有表达〔2〕。越来越多的研究显示，nesfatin-1不但在能量代谢方面起到重要的作用，其与胰岛素抵抗和糖尿病的发生发展也有着密切的关系〔3〕。然而，中枢nesfatin-1 调节胰岛素信号及糖代谢的具体作用机制目前尚不完全清楚。因此，本研究采用RNAi技术构建的nesfatin-1小干扰分子表达腺病毒Ad-shNUCB2，探索中枢nesfatin-1表达下调对胰岛素信号通路、肝脏糖异生关键基因的调控及可能的分子作用机制。

1材料和方法

1.1材料及试剂大鼠源性nesfatin-1干扰重组腺病毒载体Ad-shNUCB2由本课题组前期构建；重组绿色荧光蛋白腺病毒载体(Ad-shGFP)为空载对照病毒，由重庆医科大学检验医学院提供；人工脑脊液(aCSF)由BioPanda公司提供；组织蛋白提取试剂RIPA、PMSF及BCA蛋白测定试剂购自碧云天公司；兔抗小鼠葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)一抗、兔抗小鼠磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)一抗均购自美国Santa Cruz公司，兔抗小鼠nesfatin-1一抗购自英国ABCAM公司，兔源p-IR、IR、p-IRS-1、IRS-1、p-AKT、AKT、p-STAT3、STAT3、p-mTOR及mTOR一抗均购自美国Cell Signaling公司；兔抗小鼠β-actin一抗、HRP标记的羊抗兔IgG二抗购自北京中杉金桥公司。

1.2方法

1.2.1动物模型健康雄性四周龄SD大鼠60只，体重约100～120 g，适应性喂养1 w后，随机分为普食喂养+人工脑脊液(aCSF)输注组(NCA组)，普食喂养+Ad-shGFP输注组(NCG组)，普食喂养+Ad-shNUCB2输注组(NCN组)，高脂喂养+人工脑脊液(aCSF)输注组(HFA组)，高脂喂养+Ad-shGFP输注组(HFG组)，高脂喂养+Ad-shNUCB2输注组(HFN组)，每组10只。各组大鼠均喂养10 w，普通饲料(热卡百分比：脂肪7.39%，蛋白质18.81%，碳水化合物51.96%，其他21.94%)和高脂饲料(热卡百分比：脂肪26.8%，蛋白质14.83%，碳水化合物40.97%，其他17.5%)均由第三军医大学大坪医院的野战外科研究所实验动物中心提供。大鼠禁食5 h后，测量其体重并用氯胺酮腹腔麻醉(87 mg/kg)，备皮后，取俯卧位，头部固定于大鼠脑立体定位仪，常规皮肤消毒，沿颅顶中线皮肤切开，暴颅骨及前囟，参照脑立体定位图谱(Paxinos和Watson的大鼠脑立体定位图谱)定位第三脑室〔4〕，利用螺丝钉及玻璃离子水门汀固定套管并缝合皮肤，术后单笼喂养并预防性使用青霉素。第三脑室置管术后第5天，套管内输注血管紧张素Ⅱ10 ng(10 ng 稀释到10 μl生理盐水中)，监测大鼠饮水量，15 min饮水量<5 ml者予以剔除。恢复7 d后，空白对照组(NCA和HFA组)第三脑室内输注人工脑脊液10 μl，阴性对照组(NCG和HFG组)输注Ad-shGFP(109PFU)，干预组(NCN 和HFN组)输注Ad-shNUCB2(109PFU)。输注7 d后，低温分离大鼠肝脏及其他组织并迅速置于液氮中保存备用。

1.2.2Western印迹法检测组织蛋白表达分别取肝脏、脂肪、肌肉等组织约100 mg，加入蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制剂PMSF、磷酸酶抑制剂氟化钠、正钒酸钠等进行匀浆，冰上裂解30 min，低温高速离心30 min，取上清用BCA法测定蛋白浓度。每条泳道约加100 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，湿转于PVDF膜，4℃封闭4 h后，依次加入稀释的一抗、二抗反应，孵育过夜。经洗脱后加入化学发光试剂并置化学发光成像系统中成像，用Quantity-One软件进行图像分析，计算各条带灰度比。

1.3统计学处理使用SPSS19.0软件，组间比较采用单因素ANOVA分析及独立样本t检验。

2结果

2.1中枢Ad-shNUCB2输注对下丘脑及外周组织 nesfatin-1表达的影响与对照组比较，中枢Ad-shNUCB2 输注后大鼠下丘脑 nesfatin-1表达明显降低(P<0.05)，而外周组织(如肝、脂肪及肌肉)nesfatin-1表达无显著变化(图1，表1)。

2.2nesfatin-1表达下调对糖异生相关基因表达的影响和NCA相比，HFA组PEPCK和G6Pase蛋白的表达水平均明显升高(P<0.05)；NCN组PEPCK和G6Pase的表达较NCA或NCG组均显著升高(P<0.05)。同样，HFN组在第三脑室输注Ad-shNUCB2后，PEPCK和G6Pase蛋白的表达水平较HFA或HFG组也明显升高(P<0.05)(图2，表2)。

2.3nesfatin-1表达下调对IR、IRS-1及AKT蛋白活性的影响见图3，表3。与NCA相比，HFA组IR、IRS-1及AKT磷酸化水平明显下降(P<0.05)；NCN组在第三脑室输注Ad-shNUCB2后IR、IRS-1及AKT磷酸化水平较NCA或NCG组均明显下降(P<0.05)；HFN组在第三脑室输注Ad-shNUCB2后IR、IRS-1及AKT磷酸化水平较HFA或HFG组均明显降低(P<0.05)。

图1　中枢 Ad-shNUCB2 对下丘脑及外周组织 nesfatin-1 表达的影响

图2　中枢Ad-shNUCB2输注对肝脏PEPCK及 G6Pase表达的影响

图3　中枢 Ad-shNUCB2输注对肝脏胰岛素信号通路的影响

2.4nesfatin-1表达下调对肝脏 mTORC2及STAT3蛋白表达或活性的影响和NCA相比，HFA组mTOR、STAT3Tyr705及STAT3Ser727位点磷酸化水平明显下降(P<0.05)；NCN组mTOR、STAT3Tyr705及STAT3Ser727位点磷酸化水平与NCA或NCG组比较均明显下降(P<0.05)；HFN 组mTOR、STAT3Tyr705及STAT3Ser727位点磷酸化水平较HFA或HFG

表1　中枢 Ad-shNUCB2 对下丘脑及外周组织

与NCA组比较：1)P<0.05；与NCG组比较：2)P<0.05组表达水平也明显降低(P<0.05)(图4，表4)。

图4　中枢Ad-shNUCB2输注对肝脏STAT3及 mTOR活性的影响

指标NCANCGNCNHFAHFGHFNPEPCK0.390±0.0430.530±0.0451)0.910±0.0741)2)1.146±0.061)2)3)1.280±0.0221)2)3)4)1.920±0.0981)2)3)4)5)G6Pase1.010±0.1001.020±0.1301)1.750±0.2301)2)1.880±0.2101)2)3)1.810±0.1801)2)3)4)3.000±0.3901)2)3)4)5)

与NCA组比较：1)P<0.05；与NCG组比较：2)P<0.05；与NCN组比较：3)P<0.05；与HFA组比较：4)P<0.05；与HFG组比较：5)P<0.05；下表同

表3　中枢Ad-shNUCB2输注对肝脏IR，IRS-1，AKT蛋白活性的影响

表4　中枢Ad-shNUCB2输注对肝脏STAT3 Tyr705，STAT3 Ser727，mTOR位点磷酸化水平的影响

3讨论

在第三脑室Ad-shNUCB2输注后，我们对大鼠下丘脑和外周组织的nesfatin-1表达进行了检测，结果显示第三脑室Ad-shNUCB2输注可降低下丘脑nesfatin-1的表达，血肌肉及脂肪外周组织 nesfatin-1表达没有发生变化，验证了模型的效力，为后续研究提供了良好的实验基础。

肝糖异生是维护机体血糖处于稳态的主要糖代谢途径，肝糖异生增加是引起血糖升高及胰岛素抵抗的最主要原因之一。PEPCK和G6Pase是调节机体糖异生的关键酶，大量研究表明，胰岛素通过激活IR/IRS-1/AKT信号通路抑制PEPCK和G6Pase的表达，从而抑制肝脏糖异生〔5〕。本研究发现，无论普食喂养还是高脂喂养组，中枢Ad-shNUCB2输注后，PEPCK和G6Pase表达量均显著增高；中枢nesfatin-1表达下调能够明显抑制普食喂养或高脂喂养的大鼠肝脏IR、IRS-1及AKT磷酸化水平。课题组前期研究表明，中枢nesfatin-1表达下调能够通过促进肝糖异生，加重高脂喂养诱导的大鼠胰岛素抵抗程度。因此，结合前期研究结果，我们推测中枢nesfatin-1表达抑制可能通过抑制IR/IRS-1/AKT胰岛素信号作用通路，进而上调PEPCK和G6Pase的表达，导致肝糖异生增加，促进机体胰岛素抵抗的发生发展。

mTOR作为磷脂酰肌醇肌酶家族一员，可调控多种细胞的生长和分化〔6〕。近来，mTOR参与胰岛素信号通路的调节引起众多研究者的关注。目前已证实，mTOR存在两种复合物，包括雷帕霉素敏感复合物mTORC1和雷帕霉素不敏感复合物mTORC2。mTORC1作用于S6K1，可增加IRS-1丝氨酸磷酸化从而降低胰岛素敏感性〔7〕，而mTORC2主要通过作用于AKT丝氨酸磷酸化位点从而增加胰岛素敏感性〔8〕。本研究显示，中枢nesfatin-1表达下调能够抑制mTOR 磷酸化水平，特别是在高脂喂养动物中。因此，我们推测中枢nesfatin-1可能主要通过下调mTORC2表达，抑制AKT磷酸化，进而干扰胰岛素信号通路，对于具体的分子机制还有待于进一步研究证实。

STAT3信号通路影响机体摄食、肝糖循环和生殖功能，参与下丘脑leptin对能量和葡萄糖稳态的调节〔9〕。当受到外界刺激后，STAT3被一系列细胞因子和生长因子激活〔10〕，两两聚合转位进入细胞核并激活目标基因。本研究显示，高脂喂养能够下调STAT3磷酸化水平，而中枢nesfatin-1能在此基础上进一步抑制STAT3丝氨酸727(Ser727)和酪氨酸705(Tyr705)位点磷酸化水平。因此，nesfatin-1作为一种神经信号肽，可能通过激活mTOR/STAT3信号通路，抑制糖异生关键酶PEPCK和G6Pase的表达，从而调节机体的肝糖异生，最终引起机体对胰岛素敏感性的变化。

4参考文献

1Oh-I S，Shimizu H，Satoh T，etal.Identification of nesfatin-1 as a satiety molecule in the hypothalamus〔J〕.Nature，2006；443：709-12.

2Stengel A，Goebel M，Yakubov I，etal.Identification and characterization of nesfatin-1 immunoreactivity in endocrine cell types of the rat gastric oxyntic mucosa〔J〕.Endocrinology，2009；150：232-8.

3Yang M，Zhang Z，Wang C，etal.Nesfatin-1 action in the brain increases insulin sensitivity through Akt kinase/AMP-dependent protein kinase/target of rapamycin complex 2 pathways in diet-induced insulin resistance〔J〕.Diabetes，2012；61：1959-68.

4Paxinos G，Watson C.The rat brain in stereotaxic coordinates〔M〕.New York：Academic Press，2007:45-6.

5Steinberg GR，Watt MJ，Ernst M，etal.Ciliary neurotrophic factor stimulates muscle glucose uptake by a PI3-kinase-dependent pathway that is impaired with obesity〔J〕.Diabetes,2009；58：830-9.

6Hay N，Sonenberg N.Upstream and downstream of mTOR〔J〕.Genes Dev，2004；18：1926-45.

7Hara K，Maruki Y，Long X，etal.Raptor，a binding partner of target of rapamycin(TOR)，mediates TOR action〔J〕.Cell，2002；110：177-89.

8Sarbassov DD，Guertin DA，Ali SM，etal.Phosphorylation and regulation of Akt/ PKB by the rictor-mTOR complex〔J〕.Science，2005；307：1098-101.

9Kim JH，Yoon MS，Chen J.Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) mediates amino acid inhibition of insulin signaling through Serine 727 Phosphorylation〔J〕.J Biol Chem，2009；284：35425-32.

10Senn JJ，Klover PJ，Nowak IA，etal.Suppressor of cytokine signaling-3 (SOCS-3)，a potential mediator of interleukin-6-dependent insulin resistance in hepatocytes〔J〕.J Biol Chem，2003；278：13740-6.

〔2014-09-25修回〕

(编辑郭菁)