眼针与体针对腹泻型肠易激综合征大鼠下丘脑及结肠组织P物质及神经激肽Ⅰ型受体表达的影响

眼针与体针对腹泻型肠易激综合征大鼠下丘脑及结肠组织P物质及神经激肽Ⅰ型受体表达的影响

刘旭东王路王艳杰王哲柴纪严王德山

(辽宁中医药大学基础医学院，辽宁沈阳110847)

摘要〔〕目的观察比较眼针及体针对腹泻型肠易激综合征(D-IBS)大鼠下丘脑及结肠组织P物质(SP)及神经激肽Ⅰ型受体(NK-1)表达的影响。方法将40只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、眼针组、体针组4组，每组10只。采用慢性应激结合束缚方法建立IBS 大鼠模型。眼针组取下焦区、大肠区、肝区、脾区进行针刺，治疗7 d。用免疫组化方法检测大鼠下丘脑及结肠组织中SP和NK-1蛋白的表达；用RT-PCR方法检测大鼠下丘脑及结肠组织中SP mRNA的表达。结果与模型组比较，眼针组大鼠下丘脑和结肠组织SP和NK-1蛋白的表达以及SP mRNA的表达均明显减少(P<0.01)。结论眼针疗法优于体针，对D-IBS有治疗作用。

关键词〔〕P物质； NK-1受体；眼针；下丘脑

中图分类号〔〕R285〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家重点基础研究发展计划973自助项目(2007CB512702)

通讯作者：王德山(1951-)，男，教授，主要从事中医药对消化系统神经内分泌功能影响的研究。

第一作者：刘旭东(1980-)，男，讲师，硕士，主要从事消化道生理研究。

Effects of eye-acupuncture and acupuncture on expressions of SP and NK-1 receptors in hypothalamus in rats with diarrhea-predominanirritable bowel syndrome

LIU Xu-Dong, WANG Lu, WANG Yan-Jie,etal.

Basic Medicine College, Liaoning University of TCM, Shenyang 110847, Liaoning, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of the eye-acupuncture therapy on hypothalamus and colonic substance P (SP) and NK-1 receptors contents in rats with diarrhea-predominanirritable bowel syndrome (D-IBS) and explore its related mechanism.MethodsForty male Wistar rats were equally randomized into control, IBS model, eye-acupuncture and acupuncture groups. IBS model was established by giving the rat with chronic stress stimulation (cold-water swimming, tail clamping, electrical shock, etc.) for 18 days. Eye-acupuncture of Xiajiao (Low Energizer) Area, Pi (Spleen) Area, Gan (Liver) Area and Dachang (Large Intestine) Area were given to the rat for 20 min, twice daily for 7 d. The expressions of SP mRNA and NK-1 mRNA were measured by RT-PCR, and the expressions of SP and NK-1 protein were detected by immunohistochemistry. ResultsCompared with the model group, the expressions of SP mRNA,NK-1 mRNA and SP, NK-1 protein in rat hypothalamus and colon after the eye acupuncture therapy were both obviously decreased (P<0.01).ConclusionsEye-acupuncture could reduce hypothalamus and colonic SP and NK-1 contents in D-IBS rats, which might play a role in relieving IBS in eye-acupuncture clinic.

【Key words】SP；NK-1 receptor;Eye acupuncture；Hypothalamus

腹泻型肠易激综合征(D-IBS)作为肠易激综合征的一种亚型，是腹痛或腹部不适伴以腹泻为主要排便习惯异常的常见胃肠功能紊乱疾病。临床实践证明，眼针对胃肠运动功能具有较好的调整作用，在应用眼针防治D-IBS取得良好效果〔1〕。本课题利用D-IBS大鼠模型，观察眼针及体针疗法D-IBS大鼠模型海马和结肠组织中P物质(SP)和神经激肽Ⅰ型受体(NK-1)含量的影响，探讨眼针对IBS 治疗的作用机制。

1材料与方法

1.1动物与分组健康SPF级SD大鼠40只，北京维通利华实验动物中心提供，许可证号：SCXK(京)2007-0001。雌雄不拘，体质量(280±20)g，适应性喂养1 w，自由饮水、摄取标准颗粒饲料，室内温度22 ℃，相对湿度45%。按随机数字表法将SD 大鼠分为正常组、模型组、眼针组、体针组4 组，每组10只。

参考文献1.2IBS 模型的建立除正常组外其余大鼠均采用慢性应激结合束缚方法建立IBS模型。〔2〕的方法并作改进，在18 d中让大鼠随机循环接受6种不同的应激刺激，包括：冷水游泳(14℃，5 min)，夹尾(180 s)，禁水(24 h)，禁食(24 h)，电击(电压为30 V，电击5 s，间歇5 s，共进行120 s)，高温(温箱中，40℃，30 min)，每天随机接受1种刺激，18 d内平均每种刺激3次。同时参考文献〔3〕的方法，每天给予大鼠30%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，用胶带束缚其前肩、前上肢及胸部，限制其搔抓头面部，束缚1 h 。

1.3取穴及刺法眼针组：造模结束后开始治疗。用31号13 mm毫针，于大鼠眼眶周围2 mm处针刺，定位参照人体眼针取穴方法，取下焦区、大肠区、肝区、脾区。平刺进针3 mm，留针20 min，每12 h治疗1次，每日治疗2次，共针刺7 d。体针组：体针组左足三里，用31号13 mm毫针平刺进针3 mm，留针20 min，每12 h治疗1，每日治疗2次，共针刺7 d。

1.4试剂实时定量PCR 试剂盒购自TaKaRa大连宝生物。SP及NK-1引物由北京华大基因公司合成。亲和纯化兔抗鼠SP及NK-1多克隆抗体、DAB染色试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。SP引物序列：上游：5′-ATGAAAATCCTCGTGGCGGT-3′，下游：5′-CAGCATCCCGTTTGCCCATT-3′；NK-1引物序列：上游：5′-ATGCCCAGCAGAGTCGTGTG-3′，下游：5′-CAGTGTACGCGTAGCCGATCA-3′。

1.5指标测定及方法采用RT-PCR方法检测大鼠结肠及下丘脑SP mRNA表达，免疫组化检测大鼠结肠、下丘脑SP、NK-1蛋白表达。

1.6统计学方法采用SPSS10.0软件进行统计学分析，组间比较行方差分析。

2结果

2.1各组大鼠结肠组织SP及NK-1表达水平比较与正常组SP mRNA(0.15±0.06)和蛋白(0.171±0.022)比较，模型组结肠SP mRNA及蛋白表达水平显著升高(0.66±0.21，0.262±0.019，P<0.01)；和模型组比较，眼针组SP mRNA及蛋白(0.34±0.10,0.214±0.023)、体针组结肠SP mRNA及蛋白(0.22±0.09、0.231±0.017)表达水平显著降低(P<0.01)。与正常组NK1蛋白(0.215±0.014)比较，模型组大鼠结肠NK-1蛋白(0.246±0.015)表达水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，眼针组(0.223±0.015)和体针组大鼠结肠NK-1蛋白(0.230±0.015)的表达水平显著降低(P<0.01)；与眼针组相比，体针组无显著差异(P>0.05)。见图1～图3。

2.2各组大鼠下丘脑SP和NK-1 mRNA及蛋白表达水平的比较和正常组SP mRNA及蛋白表达(0.17±0.02、0.181±0.020)比较，模型组大鼠下丘脑SP mRNA及蛋白表达水平显著升高(0.48±0.05、0.234±0.009，P<0.01)；和模型组比较，眼针组大鼠下丘脑SP mRNA及蛋白表达水平显著降低(0.37±0.07、0.216±0.010,P<0.01)，体针组SP mRNA及蛋白表达水平显著降低(0.41±0.04、0.209±0.009,P<0.05)；和眼针组比较，体针组SP mRNA及蛋白表达水平无显著差异(P>0.05)。见图4，图5。

与正常组相比，模型组大鼠下丘脑NK-1蛋白表达水平升高(0.228±0.007 vs 0.201±0.007，P<0.01)，与模型组相比，眼针组大鼠下丘脑NK-1蛋白表达水平降低(0.215±0.006,P<0.01)，体针组无显著差异(0.224±0.010,P>0.05)；与眼针组相比体针组大鼠下丘脑NK-1蛋白表达水平升高(P<0.05)。见图6。

M为Marker，1～3泳道为正常组，4～6泳道为模型组，7～9泳道为眼针组，10～12泳道为体针组 图1　各组大鼠结肠组织SP mRNA表达

图2　各组大鼠结肠SP蛋白表达(DAB，×400)

图3　各组大鼠结肠NK-1蛋白表达(DAB,×400)

M为Marker，1～3泳道为正常组，4～6泳道为模型组，7～9泳道为眼针组，10～12泳道为体针组 图4　各组大鼠下丘脑SP mRNA表达

图5　各组大鼠下丘脑 SP蛋白表达(DAB，×400)

图6　各组大鼠下丘脑NK-1蛋白表达(DAB，×400)

3讨论

眼针疗法是根据眼球结膜上血管的形色变化，判断疾病的性质与部位，然后辨证针刺眼周穴，以治疗全身疾病的一种方法〔4〕。眼针的理论基础源于“十二经脉三百六十五络，其血气皆上于面而走空窍，其精阳气上走于目而为睛”，即眼周八区十三穴与周身十二经脉有密切联系，针刺眼周十三穴可以调整十二经脉的功能，从而取得疗效〔5〕。IBS 是一组以腹痛或腹部不适，同时伴有排便习惯改变和(或) 大便性状异常为主要症状的肠道功能性疾病。近年来发现，中枢神经系统和肠神经丛功能失调，导致脑肠轴功能异常，可能是IBS 患者对各种应激反应增强和内脏敏感性增加的主要原因。脑肠肽在调节脑肠轴功能方面起着重要的作用，具有激素和神经递质的双重性。SP 是目前研究较多的脑肠肽，在胃肠道功能调节中具有重要作用，有研究表明SP通过激活NK-1受体和NK-2受体，刺激直肠黏膜的离子交换与IBS的发生相关。最近已发现多种速激肽受体(P物质受体)拮抗剂，如TAK-637对IBS具有治疗作用〔6〕。SP能纤维主要分布在肠壁肌层〔7〕。SP作为兴奋性神经递质，在消化道的运动和分泌中起着重要作用，能够加速胃肠蠕动，促进胃肠道平滑肌收缩和胃肠道运动，加强结肠的集团推进运动，使患者排便次数增多。SP在IBS的应激、肠道感染、内脏敏感性增高及与之相关的神经-免疫-内分泌调控机制中均有重要作用〔8，9〕。本文结果表明，眼针疗法能够降低IBS 模型大鼠结肠组织及下丘脑NK-1和SP的表达，改善了IBS发病过程中脑肠轴功能的异常，对IBS起到了治疗作用，但体针组SP表达降低没有眼针效果明显，说明眼针刺激外周相关穴位，通过外周感受器与大脑皮层“点”对“点”的联系，其传出信息反射性启动靶器官神经递质、细胞因子等释放和分泌，从而调控局部血运与代谢，改善其功能，达到治疗效果。

4参考文献

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〔2014-07-19修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)