补肾活血中药复方对去卵巢大鼠骨密度和骨组织神经肽Y的影响

补肾活血中药复方对去卵巢大鼠骨密度和骨组织神经肽Y的影响

朱晓峰王廷春1杨丽2王攀攀张荣华2

(暨南大学附属第一医院，广东广州510630)

摘要〔〕目的探讨补肾活血中药复方对去卵巢大鼠骨密度及血浆和骨组织神经肽Y(NPY)的影响及对防治骨质疏松的作用机制。方法选择6月龄SD雌性大鼠32只，随机分为假手术组、模型组、补肾活血中药复方低剂量组和高剂量组。模型组、复方低剂量组与高剂量组均行双侧去卵巢手术，手术1 w后中药复方低、高剂量组用灌胃法1.16 g/100 g和10.44 g/100 g给服中药，模型组灌服生理盐水，12w后观察各组大鼠骨密度的改变，采用实时荧光定量(RT-PCR)检测骨组织NPY mRNA的表达美联免疫吸附(ELISA)法检测各组大鼠血浆和骨组织NPY含量，Western印迹检测骨组织NPY的表达。结果与假手术组比较，模型组骨密度明显降低(P<0.01)，骨组织中NPY蛋白和mRNA的表达量明显升高(P<0.01)，血清和骨组织中NPY的含量也明显升高(P<0.01)。中药复方低剂量和高剂量组骨密度明显高于模型组(P<0.01)，血浆和骨组织中NPY 蛋白和mRNA的表达量明显降低 (P<0.01或0.05)，但仍高于假手术组(P<0.01)。结论补肾活血中药复方能够调节血浆和骨组织的NPY，这可能是其抗骨质疏松的作用机理之一。

关键词〔〕补肾活血中药复方；骨质疏松；神经肽Y

中图分类号〔〕R285〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金(81173619，81473509)；广东省自然科学基金(S2012040007531)

通讯作者：张荣华(1964-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事老年病研究。

Effects of Nourishing Kidney and Activating Blood Recipe on bone mineral density and NPY in plasma and bone tissue in ovariectomized rats

ZHU Xiao-Feng,WANG Ting-Chun,YANG Li,etal.

Traditional Chinese Medicine Department,the First Affiliated Hospital,Jinan University,Guangzhou 510630，Guangdong,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of Nourishing Kidney and Activating Blood Recipe (NKABR) on bone mineral density and the levels of neuropeptide Y (NPY) of plasma and bone tissue in ovariectomized rats. Methods32 SD rats were randomly divided into sham-operated,model,NKABR low-dose and high-dose groups. After ovariectomy 1 w，NKABR groups were given intragastric administration with different doses of NKABR,model group was given normal physiological saline. After 12 w,the changes of bone mineral density was observed,the levels of NPY mRNA or protein in plasma and bone tissue were measured by real-time RT-PCR,ELISA or Western blot. ResultsCompared with that of sham-operated group,BMD of model group was decreased significantly (P<0.01),the levels of NPY mRNA and protein of serum or bone tissue were increased significantly(P<0.01).The bone mineral density of NKABR low dose and high dose group were significantly higher than those of model group(P<0.01),the levels of NPY mRNA and protein of plasma or bone tissue were significantly lower than those of model group (P<0.01 or 0.05),but still higher than those of sham-operated group(P<0.01). ConclusionsNKABR could regulate level of NPY,which might be one of anti-osteoporosis mechanisms.

【Key words】Nourishing Kidney and Activating Blood Recipe; Bone mineral density; Neuropeptide Y

1天津中医药大学中西医结合博士后流动站

2暨南大学药学院中药学教研室

第一作者：朱晓峰(1975-)，男，博士，副主任医师，主要从事老年病的研究。

研究发现一些神经肽类物质如降钙素基因相关肽(CGRP)、P物质(SP)、神经肽Y(NPY)和血管活性肠肽(VIP)等介导神经骨骼信号在骨代谢中发挥着重要作用，它们通过调节成骨细胞和破骨细胞活性及骨组织微循环参与骨代谢〔1,2〕。研究发现对骨质疏松有明确疗效的补肾活血中药复方(益骨胶囊)可缓解骨痛，调节性激素水平，影响骨组织内的相关神经递质，并可以调节血浆和骨组织中的CGRP和SP〔3,4〕。NPY在骨代谢和脂质代谢中也起着关键作用〔5〕，本研究通过探讨补肾活血复方对去卵巢SD骨质疏松大鼠血浆和骨组织中NPY的影响，进一步阐述其调节神经骨骼信号防治骨质疏松的作用机制。

1材料和方法

1.1实验药物补肾活血中药复方(益骨胶囊)药物由淫羊藿、杜仲、当归等8味药组成。灌胃药物参照既往制备工艺〔6〕。

1.1.1主要试剂戊巴比妥钠(上海化学试剂厂)；注射用青霉素钠(华北制药股份有限公司)；NPY ELISA检测试剂盒(Abnova)；ECL 发光试剂盒(Pierce)；β-tubulin兔抗大鼠Ⅰ抗、NPY兔抗大鼠Ⅰ抗、羊抗兔Ⅱ抗(Santa Cruz)。SDS、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、考马斯亮蓝G250(AMRESCO)；PVDF膜(Axygen)。

1.1.2主要仪器Prodigy型双能X线骨密度仪(Lunar)；2-16K型高速冷冻离心机(Sigma)；PTC-200型梯度PCR仪、垂直电泳槽、转移电泳槽、Model680型酶标仪(Bio-Rad)；BT2202s型电子分析天平(Sartorious)。

1.1.3实验动物6月龄SD雌性大鼠，体重(280±20)g，购于广东省医学实验动物中心，实验动物许可证号；SCXK(粤)2008-0002。

1.2实验方法

1.2.1分组与模型制备将32只6月龄SD雌性大鼠随机分假手术组、模型组、补肾活血中药复方低剂量组和高剂量组，每组8只。进行双侧卵巢切除术〔4〕：各组动物均以2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，将大鼠取仰卧位，固定四肢、头部于动物手术台上，术区剃毛，消毒，铺手术孔巾，取大鼠下腹部正中，沿腹白线纵行切口2～3 cm，切开皮肤及皮下组织，钝性分离肌肉，打开腹腔，找到双侧卵巢，提起卵巢，用手术线将其周围相连血管及输卵管结扎，后切除，切口缝合，消毒，假手术组做同样切口，找到卵巢后不切除直接缝合，术后均予青霉素10万单腹腔注射3 d预防感染。

1.2.2给药方法手术1 w后开始给药，大鼠灌胃给药，参考既往研究文献〔4〕，低剂量按人日用临床剂量，经人-大鼠体表面积比值折算，1.16 g/100 g给药，高剂量组予低剂量的6倍(10.44 g/100 g)，空白组予以同等体积的生理盐水，1次/d。

1.2.3骨密度检测灌胃12 w后，2%戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉，四肢展开平置于Prodigy型双能X线骨密度仪平台上检测骨密度。

1.2.4血浆和骨组织NPY含量的检测检测骨密度后进行心脏采血，将心液注入含7.5%乙二胺四乙酸(EDTA)30 μl和抑肽酶40 μl的预冷试管(4℃)内，3000 r/min 4℃离心10 min，取上清注入预冷的试管(4℃)内，存于-80℃冰箱待测。酶联免疫吸附(ELISA)法测定血浆NPY含量，均按说明书进行。

大鼠处死后置于冰上，迅速取出双侧股骨头，用滤纸吸干表面液体，将股骨头用电子天平称重后，置于盛有液氮的研钵内用手术剪剪碎，移入匀浆器内，每100 mg组织加入1 ml生理盐水，冷冻匀浆，将匀浆后液体分装入离心管内，3 000 r/min 4℃离心10 min，取上清液置于-80℃的冰箱中保存待测。检测方法同血浆中NPY的检测。

1.2.5骨组织NPY mRNA检测采用实时荧光定量PCR法，取大鼠股骨头大鼠处死后取出双侧股骨头，电子天平称重后，置于盛有液氮的研钵内用手术剪剪碎，移入匀浆器内，每100 mg组织加入1 ml生理盐水，冷冻匀浆用TRIzol法提取总RNA，紫外分光光度计在UV260/280下测定纯度并定量。步骤包括逆转录反应；PCR反应；染料法(SYBR Green I)相对定量分析，实验按照△△Ct解析法设计。扩增条件：95℃预变性10 min，(95℃变性10 s,60℃退火30 s,72℃延伸15 s)×40个循环。以GAPDH为内参照做平型管，根据GenBank网站中大鼠的NPY的基因序列(NM_012614)和内参GAPDH的基因序列(NM_017008)，采用Primer 5.0软件设计引物。NPY引物序列：正义：5′-GTG TTT GGG CAT TCT GGC TG-3′，反义：5′- AGT GTC TCA GGG CTG GAT CT-3′，扩增产物长度为159 bp；GAPDH引物序列：正义：5′- ACA TGC CGC CTG GAG AAA CCT -3′，反义：5′- GCC CAG GAT GCC CTT TAG TGG -3′，扩增产物长度为90 bp。反应结束后根据Ct值进行计算和统计。

1.2.6骨组织NPY蛋白表达的检测匀浆，用Western印迹检测NPY蛋白的表达。

1.3统计学处理使用SPSS16.0软件，组间比较采用单因素方差分析，方差齐同的采用LSD检验，方差不齐的采用Tamhane's方法。

2结果

2.1各组大鼠骨密度比较与假手术组〔(0.439±0.032)g/cm2〕比较，模型组大鼠骨密度〔(0.227±0.030)g/cm2〕明显降低(P<0.01)，补肾活血中药复方低、高剂量组骨密度〔(0.311±0.016)、(0.395±0.022)g/cm2〕均高于模型组(P<0.01)，但仍低于假手术组(均P<0.01)。

2.2各组大鼠血浆、骨组织NPY含量的变化与假手术组相比，模型组大鼠血浆和骨组织中NPY含量显著升高(P<0.01)，用药各组血浆和骨组织中NPY含量均显著低于模型组，但仍高于假手术组(P<0.01)，见表1。

表1　各组大鼠血浆和骨组织中NPY含量

与假手术组比较:1)P<0.01；与模型组比较:2)P<0.01

1～4：假手术组、模型组、补肾活血复方低剂量组、补肾活血复方高剂量组 图1　各组骨组织NPY蛋白的表达

2.3各组大鼠骨组织中NPY mRNA和蛋白相对表达的变化图1，表2可见，与假手术组相比，模型组大鼠骨组织中NPY mRNA和蛋白的相对表达量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，用药各组骨组织中NPY mRNA和蛋白的相对表达量均显著低于模型组，但仍高于假手术组，差异均具有统计学意义(P<0.01或0.05)。

表2　各组大鼠骨组织NPY mRNA和蛋白相对

与假手术组比较:1)P<0.01；与模型组比较:2)P<0.01，3)P<0.05

3讨论

近年来，神经信号在调节骨量的作用上不取得突破，其中一个重要的介质是NPY系统，NPY是一个由36个氨基酸组成的多肽，在中枢和周围神经系统中广泛表达，通过G蛋白耦联的受体在骨骼和能量代谢等许多生理过程中起着重要作用，其受体根据克隆的时间先后分别称为Y1、Y2、Y4、Y5、Y6受体〔7,8〕。研究证实，NPY在骨和脂肪的形成中起着重要作用，侧脑室注射NPY后野生型小鼠松质骨体积明显减少，NPY在下丘脑中过表达可以使成骨细胞活性下降7倍，尤其在皮质骨以及松质骨的表面情况更为明显；NPY也存在于成骨细胞、骨细胞和破骨细胞中，外周NPY在骨细胞中能通过旁分泌和自分泌起作用；NPY还能抑制骨髓基质细胞向成骨样细胞分化，研究显示，NPY可以使颅骨的成骨细胞数量减少，但不能减少NPY1受体敲除小鼠成骨细胞的数量，在对成骨细胞活性的影响上，NPY可以减少成骨细胞骨钙素和DMP-1基因的表达，减少矿化结节的形成〔9,10〕。NPY与雌激素也有密切的关系，研究发现雌激素可以通过影响NPY的表达从而影响体内能量平衡〔11〕；NPY和雌激素可以共同调节成骨细胞和脂肪细胞的形成，决定骨形成的方向〔12〕。

补肾活血复方由淫养藿、熟地、枸杞、牛膝等药组成，具有补肾壮骨、活血止痛的功效，方中淫羊藿补肾壮骨为君药，枸杞子滋阴柔肝补肾为臣药，当归养血补血，又能活血止痛，补中有通，行中有补，再配合牛膝既补肝肾又引药归经，对因虚而致瘀者可发挥治标之用。研究显示本方还可以提高骨组织Ⅰ型胶原mRNA和成骨细胞分化因子cbfα-1mRNA在去卵巢骨质疏松大鼠骨组织的表达〔13,14〕，调节神经骨骼信号中的CGRP和SP〔4〕，提高体外培养成骨细胞中骨形态发生蛋白2(bmp-2)和骨保护素(OPG)的表达〔15〕。

本研究说明了NPY升高可能是去卵巢大鼠雌激素降低后骨质疏松的一个发病机制。另外降低NPY的表达可能是其抗骨质疏松的作用机理之一。但是在本项研究中仅探讨了NPY在骨组织和血浆中的变化，需进一步研究NPY及其受体在骨质疏松模型中中枢和周围神经系统及骨组织中的分布与变化，全面阐述NPY在骨质疏松发病中的作用以及与雌激素之间的关系，进一步探讨细胞内的分子信号传导机制及的调节方式，为中医学“肾主骨生髓，髓通脑”理论提供科学的阐释。

4参考文献

1Elefteriou F.Regulation of bone remodeling by the central and peripheral nervous system〔J〕.Arch Biochem Biophys,2008;473(2):231-6.

2Ma W,Zhang X,Shi S,etal.Neuropeptides stimulate human osteoblast activity and promote gap junctional intercellular communication〔J〕.Neuropeptides,2013;47(3):179-86.

3Zhang RH,Chen KJ,Lu DX,etal.A clinical study of yigu capsule in treating postmenopausal osteoporosis〔J〕.Chinese J Integr Med,2005;11(2)：97-103.

4朱晓峰，王廷春，张荣华，等.益骨胶囊对去卵巢大鼠骨密度及血浆和骨组织CGRP和SP含量的影响〔J〕.时珍国医国药，2012;23(5):1054-6.

5Wong IP,Nguyen AD,Khor EC,etal.Neuropeptide Y is a critical modulator of leptin's regulation of cortical bone〔J〕.J Bone Miner Res,2013;28(4):886-98.

6张荣华，彭柯萍，朱晓峰，等.益骨胶囊含药血清对大鼠成骨细胞ERmRNA及其蛋白表达的影响〔J〕.中国中西医结合杂志，2005;25(4):333-7.

7Shi YC,Baldock PA.Central and peripheral mechanisms of the NPY system in the regulation of bone and adipose tissue〔J〕.Bone,2012;50(2):430-6..

8Lee NJ,Herzog H.NPY regulation of bone remodelling〔J〕.Neuropeptides,2009;43(6):457-63.

9Lee NJ,Doyle KL,Sainsbury A,etal.Critical role for Y1 receptors in mesenchymal progenitor cell differentiation and osteoblast activity〔J〕.J Bone Miner Res,2010;25(8):1736-47..

10Khor EC,Baldock P.The NPY system and its neural and neuroendocrine regulation of bone〔J〕.Curr Osteoporos Rep,2012;10(2):160-8.

11Dufourny L,Warembourg M.Estrogen modulation of neuropeptides:somatostatin,neurotensin and substance P,in the ventrolateral andarcuate nuclei of the female guinea pig〔J〕.Neurosci Res,1999;33(3):223-8.

12Byerly MS,Al Salayta M,Swanson RD,etal.Estrogen-related receptor β deletion modulates whole-body energy balance via estrogen-related receptor γ andattenuates neuropeptide Y gene expression〔J〕.Eur J Neurosci,2013;37(7):1033-47.

13张荣华,彭勇,杨丽,等.益骨胶囊对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织Ⅰ型胶原mRNA表达的影响〔J〕.时珍国医国药，2005;16(10):941-3.

14黎波,张荣华.益骨胶囊对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织cbfα-1mNRA表达的影响〔J〕.中国病理生理杂志，2008;24(4):759-62.

15朱晓峰,王廷春,张荣华，等.益骨胶囊含药血清对晚期糖基化终末产物作用下成骨细胞分化及BMP-2和OPG的影响〔J〕.中国中西医结合杂志，2012;32(4):525-9.

〔2014-08-29修回〕

(编辑郭菁)