司来吉兰联合左旋多巴对帕金森病模型大鼠结肠TH及nNOS表达的影响

毕树立 高海英

1）河北唐山市开平医院急诊科 唐山 063021 2）河北唐山市丰南区医院 唐山 063300

司来吉兰联合左旋多巴对帕金森病模型大鼠结肠TH及nNOS表达的影响

毕树立1）高海英2）

1）河北唐山市开平医院急诊科 唐山 063021 2）河北唐山市丰南区医院 唐山 063300

目的 观察司来吉兰联合左旋多巴对帕金森病模型大鼠结肠中TH及nNOS表达的影响，探讨司来吉兰联合左旋多巴对帕金森病消化系统功能紊乱的可能机制。方法 72只健康雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组及联合治疗组，每组均设4d及8d2个时间点。采用颈背部皮下注射鱼藤酮制备帕金森病模型大鼠，模型制备成功后，联合治疗组每日灌胃1次司来吉兰0.5mg/kg及2次左旋多巴15mg/kg，直至试验时间点。对照组及模型组每只每日均连续灌胃等体积生理盐水至试验时间点。应用免疫组化法S-P法以及Western blotting检测TH及nNOS在对照组、模型组以及联合治疗组大鼠结肠组织中的表达情况。结果 造模成功后，免疫组化及Western blotting结果均显示，模型组大鼠结肠中的TH表达较对照组明显减低（P＜0.05）；通过司来吉兰联合左旋多巴治疗后，联合治疗组TH表达显著高于模型组，但仍低于对照组（P＜0.05），治疗8d时较治疗4d时，TH表达无显著差异（P＞0.05）。nNOS在模型组中的表达较对照组以及联合治疗组明显增多（P＜0.05），且联合治疗组中nNOS表达较对照组增多（P＜0.05），治疗8d时较治疗4d时，nNOS表达无显著性差异（P＞0.05）。结论 帕金森病大鼠结肠组织中的TH表达降低，而nNOS表达增加。司来吉兰联合左旋多巴能缓解PD后TH的降低以及nNOS的升高，能有效缓解帕金森大鼠的肠道功能紊乱。

司来吉兰；左旋多巴；酪氨酸羟化酶；nNOS；帕金森病；结肠

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是临床常见的发生在中老年人的神经系统退行性变性疾病。除了典型的运动症状表现之外［1］，常伴有便秘等结肠功能紊乱。本研究以鱼藤酮制作的帕金森病大鼠模型为对象，观察司来吉兰联合左旋多巴治疗对帕金森病大鼠模型结肠中TH及nNOS表达的影响，探讨司来吉兰联合左旋多巴在帕金森患者结肠功能紊乱中的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 盐酸司来吉兰（Orion Corporation，芬兰）；鱼藤酮（北京博奥森生物工程有限公司，北京）；葵花油（唐山沃尔玛超市，唐山）；兔抗大鼠TH抗体和兔抗大鼠nNOS抗体（cell signaling technology，美国）；SP免疫组化试剂盒、DAB显色液购自（中杉生物有限公司，北京）；奥林巴斯BX63全自动显微镜扫描系统（OLYMPUS，日本）。

1.2 实验动物 体质量250～280g的健康雄性SD大鼠72只，按照随机化原则将实验动物随机分为正常对照组（对照组）、帕金森病模型组（模型组）和司来吉兰联合左旋多巴治疗组（联合治疗组），各组再随机分为模型制作成功后4d和8d两个时间点，每组每个时间点各12只。

1.3 试验方法

1.3.1 帕金森病模型的制备：采用颈背部皮下注射鱼藤酮制备帕金森病模型。具体操作方法：鱼藤酮应用葵花油溶解配制成2mg/mL鱼藤酮葵花油乳液，充分震荡混匀后避光保存。PD组和联合治疗组大鼠称重以后以鱼藤酮2mg/kg体质量计算鱼藤酮葵花油乳液用量。捏起大鼠颈背部皮肤，用1mL注射器皮下注射鱼藤酮葵花油乳液。以出现行为学改变作为判定模型成功的指标［3］，选择2～6分为实验大鼠。模型制备成功后，治疗组：司来吉兰（0.5mg/kg）灌胃1次/d，左旋多巴（15mg/kg）灌胃2次/d，分别连续给药4d和8 d。对照组及PD组每只每日均连续灌胃等体积生理盐水，直至试验时间点。

1.3.2 标本制备及检测：腹腔注射10％水合氯醛溶液3 mL/kg麻醉实验大鼠。满意后用4％多聚甲醛灌流组织固定，剖腹后取大鼠结肠，清洗干净后去除多余组织，取约3cm肠标本多聚甲醛固定24h过夜行免疫组化检测，另取约3cm肠标本投入液氮，于-80°保存以备行Western blotting。免疫组化检测：将结肠标本制作成石蜡切片，采用免疫组化SP法，切片常规脱蜡脱水，3％H2O2溶液室温作用封闭内源性酶，微波进行抗原修复，滴加血清封闭，滴加适当稀释的兔抗大鼠一抗（TH、nNOS均为1∶200），湿盒孵育，4℃过夜，滴加HRP标记山羊抗兔二抗，37℃恒温箱孵育30min，蒸馏水洗涤后DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、中性树脂封片，显微镜观察。采用Image Pro-Plus6.0图像分析软件分析。每张切片在高倍镜下观察，阳性产物为棕黄色，以积分光密度（intensive optical density，IOD）为指标进行图像分析，计算5个高倍显微镜下平均光密度值。Western blotting蛋白印记：取各组制备好的大鼠结肠组织20μg，10％SDSPAGE电泳分离后，以湿转法电转移至PVDF膜上。转移后的PVDF膜于封闭液中封闭，然后分别加入兔抗大鼠TH一抗（1∶500）、兔抗大鼠nNOS一抗（1∶1 000）孵育过夜。PBS洗膜，加人相应浓度的二抗（羊抗兔，1∶2 000），室温反应1h，洗膜后ECL显色，胶片曝光显影后，使用Image J软件进行测定平均灰度值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，计量资料以（±s）表示，组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠结肠组织TH及nNOS免疫组化检测结果

联合治疗组大鼠结肠组织TH在各实验时间点平均光密度明显强于对照组及模型组（P＜0.05），模型组大鼠结肠组织TH各试验时间点平均光密度明显强于对照组（P＜0.05）。模型组nNOS的平均光密度，较对照组明显升高（P＜0.05）；经司来吉兰联合左旋多巴治疗后，nNOS的平均光密度，较对照组明显升高（P＜0.05），但较模型组明显降低（P＜0.05）。联合治疗组TH及nNOS的平均光密度，第8天与第4天比较，无显著性差异（P＞0.05）（见表1）。

表1 3组大鼠结肠组织中TH及nNOS平均光密度比较（±s）

表1 3组大鼠结肠组织中TH及nNOS平均光密度比较（±s）

注：a与对照组比较，P＜0.05；b与对照组比较，P＜0.05；c与模型组比较，P＜0.05

组别TH nNOS 4d 8d 4d 8d对照组 172.52±5.86 170.43±4.22 80.45±3.62 82.35±4.43模型组 110.32±5.45a 109.28±5.26a 120.24±6.42a 124.04±5.28a联合治疗组 136.28±5.25b c 140.42±5.31bc 102.54±5.43b c 99.46±5.64b c

2.2 Western blotting蛋白印记检测结果 模型组TH蛋白的表达，较对照组对应各时间点明显降低（P＜0.05），经司来吉兰联合左旋多巴治疗后，较模型组对应各时间点明显升高，但较对照组对应各时间点仍低（P＜0.05），联合治疗组第8天与第4天比较，无显著性差异（P＞0.05）。模型组nNOS蛋白的表达，较对照组对应各时间点明显升高（P＜0.05），经司来吉兰联合左旋多巴治疗后，较模型组对应各时间点明显降低，但较对照组对应各时间点仍高（P＜0.05），联合治疗组第8天与第4天比较，无显著差异（P＞0.05）（见表2）。

表2 3组大鼠结肠组织中TH及nNOS Western blotting表达比较（±s）

表2 3组大鼠结肠组织中TH及nNOS Western blotting表达比较（±s）

注：a与对照组比较，P＜0.05；b与对照组比较，P＜0.05；c与模型组比较，P＜0.05

组别TH nNOS 4d 8d 4d 8d对照组6.42±0.48 6.50±0.45 0.35±0.04 0.37±0.02模型组 3.26±0.45b 3.05±0.48b 1.24±0.05b 1.26±0.04b联合治疗组 5.67±0.42ac 5.70±0.54a c 0.48±0.02a c 0.46±0.03a c

3 讨论

帕金森病（PD）是神经退行性疾病，主要是脑内黑质多巴胺能神经元变性而导致合成多巴胺能力下降，纹状体缺乏多巴胺引起。其患者除临床常见的典型运动症状表现之外，常伴有便秘等结肠功能紊乱，PD患者结肠功能紊乱具体机制尚不清楚，可能与中枢神经系统、自主神经系统及肠神经系统及其递质相关。

酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）是催化去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺等儿茶酚胺类活性物质生物合成的限速酶［4-5］，TH活性的升高或降低直接影响儿茶酚胺类活性物质的合成，从而产生不同生物学效应，影响机体的生理功能。结肠的排空受结肠移行运动影响，帕金森病患者出现便秘等结肠功能紊乱时，其结肠巨大移行收缩波受到抑制，抑制胃肠道运动的多巴胺作为抑制性递质在结肠排空运动中起到重要作用。结肠交感神经节后纤维释放的去甲肾上腺素影响结肠平滑肌舒张功能，TH的升高或降低，直接影响去甲肾上腺素合成，从而影响结肠平滑肌的功能。本研究中，运用鱼藤酮制备帕金森病模型，发现TH在模型组中的表达明显低于对照组，且在第4天及第8天时，无显著差异（P＞0.05）。表明TH在鱼藤酮制备帕金森病模型中合成减少，从而影响结肠儿茶酚胺类活性物质的合成，进而抑制胃肠道的运动，从而导致便秘等。

一氧化氮（NO）为具有脂溶性的自由基性质气体，自被发现以来，因其兼有第二信使及神经递质的作用而逐渐受到关注［6-7］。NO的合成与一氧化氮合酶（NOS）密切相关，目前已经确定的NOS有三种，神经元型NOS（nNOS）、内皮型NOS（eNOS）及诱导型NOS（iNOS），其中nNOS在中枢神经系统主要存在于小脑、嗅球、丘脑、海马及大脑皮层，在正常生理情况下，多巴胺的释放受NO的的调节，病理情况下，NO加剧多巴胺能神经元的损伤。本研究通过检测帕金森模型大鼠结肠中nNOS的表达，发现帕金森模型组结肠组织中nNOS较对照组明显增加（P＜0.05），表明神经元的退行性变后能引起nNOS的表达增加，进而NO表达增强，能加剧对神经元损伤，从而发生便秘等结肠功能障碍。研究表明，神经元的损伤能引起许多脑区的nNOS表达增加［8］。

司来吉兰是一种不可逆性的单胺氧化酶抑制剂，能够不可逆地抑制多巴胺降解为高香草酸，从而增加多巴胺的蓄积，从而改善多巴胺患者临床症状［9］。帕金森模型大鼠经司来吉兰与左旋多巴治疗后，大鼠结肠组织中，TH的含量较模型组增强，表明经联合治疗后，能有效改善胃肠道运动，进而改善便秘的发生。模型组经联合治疗后，nNOS的表达较模型组显著降低，表明NO的生成减弱，从而对神经元的损伤减轻，能改善便秘等结肠功能紊乱的发生。司来吉兰联合左旋多巴治疗帕金森病大鼠，通过升高TH的表达及降低nNOS的表达而改善模型大鼠的结肠功能紊乱。但其具体机制尚有待进一步研究。

［1］Zou YM，Tan JP，Li N，et al.The Prevalence of Parkinson＇s disease ontinues to rise after 80years of age：a cross-sectional study of Chinese veterans［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2014，18（24）：3 908-3 915.

［2］陈忻，张楠，赵晖，等.鱼藤酮致帕金森病大鼠行为学与黑质病理损伤的关系［J］.中国神经精神疾病杂志，2008，34（4）：232-234.

［3］樊志刚，乔蕾.酪氨酸羟化酶修饰人脐血间充质干细胞移植帕金森病大鼠纹状体内的多巴胺含量［J］.中国组织工程研究，2014，18（45）：7 285-7 289.

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［6］段国贤，周开顺，赵利军，等.一氧化氮在大鼠肢体缺血/再灌注后肾组织细胞凋亡中的意义［J］.中国应用生理学杂志，2009，25（2）：281-282；285.

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［8］Marconi S，Zwingers T.ComParative efficacy of selegiline versus rasagiline in the treatment of early Parkinson＇s disease［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2014，18（13）：1 879-1 882.

［9］Muller T，Hoffmann JA，DimPfel W，et al.Switch from selegiline to rasagiline is beneficial in Patients with Parkinson＇s disease［J］.J Neural Transm，2013，120（5）：761-765.

（收稿2014-10-11）

R-332

A

1673-5110（2015）10-0036-03

唐山市科学技术研究与发展指导计划，项目编号：13130292a