姜黄素抑制小胶质细胞NADPH氧化酶保护多巴胺能细胞的机制研究

崔群力郑州大学第二附属医院神经内科 郑州 450014

姜黄素抑制小胶质细胞NADPH氧化酶保护多巴胺能细胞的机制研究

崔群力
郑州大学第二附属医院神经内科 郑州 450014

目的 探讨小胶质细胞在多巴胺能细胞损伤中的作用，以及姜黄素通过抑制小胶质细胞反应保护多巴胺能细胞的机制。方法 选用大鼠嗜铬细胞瘤株PC12细胞，用鱼藤酮诱导其损伤建立帕金森病细胞模型；用姜黄素预处理4h的BV-2细胞再经鱼藤酮处理4h后的细胞上清液作为条件培养液（microglia conditioned medium with curcumin，MCMC），处理PC12细胞。应用四甲基偶氮唑盐法（MTT法）检测细胞活力；DCFH-DA染色检测BV-2细胞内活性氧类物质（ROS）的水平；Western blotting法检测NADPH氧化酶P47-phox亚基在BV-2细胞膜上的表达。结果 与对照组相比，经姜黄素预处理的BV-2细胞ROS水平降低（P＜0.01）；受MCMC处理的PC12细胞活力增加（P＜0.01）。姜黄素预处理使结合到BV-2细胞膜的NADPH氧化酶P47-phox亚基明显降低（P＜0.05）。结论 鱼藤酮通过激活小胶质细胞内NADPH氧化酶产生ROS，损伤多巴胺能细胞。姜黄素能够抑制小胶质细胞内NADPH氧化酶的激活，减少ROS的产生，进而保护多巴胺能细胞。

姜黄素；鱼藤酮；PC12细胞；条件培养液；小胶质细胞；NADPH氧化酶

既往多从多巴胺能神经元的角度探索帕金森病（PD）的发病机制，自从在PD患者和动物模型脑组织中发现黑质致密部不仅有大量多巴胺能神经元缺失，还有胶质细胞的增生［1］，炎症反应在PD发病中的作用日益受到重视。小胶质细胞是中枢神经系统中的免疫细胞，通过分泌具有神经毒性的ROS在PD中产生致病作用［2］。因此，抑制小角质细胞过度激活所介导的炎症反应可能代表了PD治疗的一个研究方向。

姜黄素是食用姜黄的主要成分，具有抗炎、抗氧化作用，能够调节和抑制小胶质细胞的表达和迁移［3］。为此，我们采用鼠神经生长因子诱导过的PC12细胞作为细胞模型，用鱼藤酮作用于BV-2细胞后，含有炎性细胞因子的条件培养液处理PC12细胞，观察PC12细胞的存活率及凋亡，探讨小胶质细胞激活后对多巴胺能神经细胞的影响，研究姜黄素抑制小胶质细胞激活及保护多巴胺能细胞的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器 姜黄素、鱼藤酮、购自美国Sigma公司；其余试剂为国产分析纯。PC12细胞在高糖DMEM培养基中培养，内含10％胎牛血清。在通有5％ CO2、37℃的培养箱中培养，隔天换液1次。细胞丰度达70％～80％时传代1次，并于细胞丰度达70％～80％时进行试验。BV-2细胞在含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养。在体积分数为5％CO2、37℃的培养箱中培养，隔天换液1次。细胞丰度达70％～80％时传代1次，并于试验前更换培养基。

条件培养液处理PC12细胞：姜黄素预处理BV-2细胞4h加入10nmol/L终浓度的鱼藤酮共孵育6h，收集培养上清，作为PC12细胞的条件培养液（microglia conditioned medium with curcumin，MCMC）。实验前更换PC12细胞的培养基，将条件培养液加入PC12细胞继续培养。细胞培养后24h观察细胞存活率及凋亡情况。

1.2 噻唑蓝（MTT）比色法检测PC12细胞活力 将细胞浓度1×108～1×109L-1的PC12细胞，按1×104～1×105个细胞/孔接种（每孔加细胞悬液90μL）于96孔培养板，每组6个复孔。另设调零孔不接种细胞，只加培养基，其他条件相同。鱼藤酮组分别加入适量的鱼藤酮稀释液（每孔10μL），使其终浓度为10nmol/L；姜黄素预处组组（姜黄素药物终浓度分别为0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L预处理4h后，与鱼藤酮终浓度10nmol/L共孵育BV-2细胞6h，收集培养液作为PC12细胞的条件培养液）4组，共6组，共孵育6h，对照组不加任何药物（每孔终体积100μL）。孵育24h后每孔加入10μL MTT（5mg/mL），37℃，继续孵育4h，加入100μL DMSO，振荡10min至甲月赞颗粒充分溶解，在570nm波长下用酶标仪测定各孔OD值。

1.3 DCGH-DA染色法检测BV-2细胞内活性氧类物质（ROS）水平 DCFH-DA（2＇-7＇-二氯荧光乙酰乙酸盐）是一种能自由通过细胞膜染色剂，其本身不发出荧光，当被细胞内ROS氧化为荧光化合物DCF时便发出荧光。通过检测DCF的荧光强度，反映细胞内ROS的水平。

分组及药物处理：姜黄素预处理组（0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L）4组；鱼藤酮组；空白对照组，共6组。按要求加入姜黄素使其终浓度为0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L预处理4h后，加入鱼藤酮终浓度为10nmol/L，空白对照组不加任何药物培养基培养，置37℃5％CO2细胞培养箱培养24h。按照试剂盒说明书操作，收集细胞。进行流式细胞仪检测：波长488nm氩离子激光，观察50 000个细胞以上——波峰右移，表明活性氧（ROS）含量高。

1.4 Western blotting法检测BV-2胞膜NADPH氧化酶的表达 实验分组及药物处理：按要求将BV-2分：胞浆蛋白对照组；膜蛋白对照组；以上2组不加任何药物；姜黄素预处理组（0.5μmol/L、1.0μmol/L、5.0μmol/L）3组；鱼藤酮对照组组；apocynin对照组，共7组。不同浓度姜黄素或apocynin（1mmol/L）预处理4h后按要求加鱼藤酮至终浓度10 nmol/L共孵育24h后搜集细胞。

细胞裂解提取膜蛋白（采用天然膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract（M-PEK），MERCK，Cat.No：444810）：膜蛋白对照组；姜黄素预处理组（0.5μmol/L、1.0μmol/L、5.0μmol/L）3组；鱼藤酮对照组组；apocynin对照组，以上6组进行提取胞膜蛋白。细胞裂解分离提取浆/核蛋白（采用天然浆/核蛋白分离抽提试剂盒NucBuster Protein Exaction Kit，MERCK，Cat.No：71183-3）：胞浆蛋白对照组BV-2细胞进行提取胞浆蛋白。SDS-PAGE电泳：每泳道加总蛋白20μg进行SDS-PAGE凝胶电泳后电转移至PVDF膜上，用5％脱脂奶粉TBST液浸泡3h，Ⅰ抗孵育4℃过夜（抗体稀释度1∶500），用TBST液洗膜5min×3次，与辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗（抗体稀释度1∶2 000）室温下孵育1h，用TBST液洗膜5min×3次，将膜放在1mL ECL发光试剂混合液中孵育约1min，吸掉混合液，保鲜膜固定，X线胶片曝光1～10min，显影、定影。定影及DAB显色，将反应的显影条带扫描，图像保存入计算机，用Bandscan 5.0软件对图像进行分析。

1.5 统计学处理 数据由SPSS 13.0软件进行统计学分析，检测结果采用均数±标准差（±s）表示，多组数据间比较采用单因素方差分析，2组数据间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT检测条件培养液对PC12细胞增殖活力的影响 鱼藤酮组与对照组比较，PC12细胞活力显著降低（P＜0.01）；姜黄素预处理的条件培养液使PC12细胞活力增加，与鱼藤酮组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。如图1示。

图1 条件培养液对PC12细胞活力的影响

2.2 DCGH-DA染色法检测BV-2细胞内活性氧类物质（ROS）水平 以DCFH-DA荧光强度反映ROS水平，空白对照组细胞的ROS水平为（100±9.39）％，应用鱼藤酮10nmol/L处理24h后，可使细胞内产生大量的活性氧，荧光强度增加，细胞ROS水平升至对照组的（187.9±20.5）％，差异有极显著统计学意义（P＜0.01）。姜黄素预处理4h后和10nmol/L鱼藤酮共同孵育24h，可拮抗ROS的生成，荧光强度明显降低，其中1.0μmol/L和5.0μmol/L姜黄素的抑制作用最强。与空白对照组相比，上述各浓度姜黄素预处理组细胞ROS水平分别为对照组的（187.9±20.5）％、（142.9±15.1）％、（137.1±17.6）％和（151.0±16.8）％。0.5μmol/L姜黄素组与鱼藤酮组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；1.0μmol/L、5.0μmol/L、10μmol/L姜黄素组与鱼藤酮组比较差异有极显著统计学意义（P＜0.01）。

2.3 Western blotting法检测BV-2细胞胞膜NADPH氧化酶p47phox亚基的转移率 膜蛋白对照组：BV-2细胞胞膜NADPH氧化酶p47phox亚基处于很低水平；鱼藤酮组：鱼藤酮诱导后，NADPH氧化酶p47phox亚基向胞膜转移，BV-2细胞胞膜NADPH氧化酶p47phox亚基处于较高水平，与膜蛋白对照组比较差异有极显著统计学意义（P＜0.01）；姜黄素预处理和NADPH氧化酶抑制剂（apocynin）均显著抑制了NADPH氧化酶p47phox亚基向细胞膜的转移，从而抑制了BV-2细胞NADPH氧化酶的活性，其中以5.0μmol/L姜黄素抑制作用最强，与鱼藤酮组比较差异有极显著统计学意义（P＜0.01）。见图2。

图2 姜黄素对鱼藤酮诱导的BV-2细胞NADPH氧化酶转移率的影响

3 讨论

PD是一种神经变性疾病，以中脑黑质多巴胺能神经元进行性丢失为特征。近年来的研究认为，炎症反应是神经系统变性疾病共有的重要特征。在炎症反应过程中，小胶质细胞是关键因素。小胶质细胞与炎症反应和神经毒性有密切关系。目前认为，小胶质细胞的过度激活导致了神经变性疾病的慢性进展、是PD进行性发展的驱动力［4］。小胶质细胞内含有NADPH氧化酶，其在炎症和神经变性间起重要作用。小胶质细胞通过NADPH氧化酶产生大量自由基，NADPH氧化酶可能是小胶质细胞源性ROS的原始来源和小胶质细胞内促发炎症信息的一个重要机制。当小胶质细胞被激活时，NADPH氧化酶胞质亚基p47磷酸化后同p67、p40和Rac2结合转移到胞膜，同结合与胞膜的亚基细胞色素b558相结合，从而装配成具有活性的酶，催化产生细胞外过氧化物［5］。NADPH氧化酶不仅产生小胶质细胞外ROS，也是小胶质细胞信息系统的重要成分，调节小胶质细胞几种炎症介质的表达。因此，阻断或抑制小胶质细胞介导的炎症反应，进而阻断炎症反应介导的神经元损伤，从而减缓神经变性疾病的进展可能是神经变性疾病的一个治疗方向。

姜黄素具有抗氧化、抗炎作用，能够保护由MPP+、MPTP、6-羟多巴胺诱导的神经变性；能通过NF-κB信号通路抑制炎症因子的转录而发挥抗炎作用［6］。为此，我们采用姜黄素预处理BV-2细胞观察鱼藤酮诱导的小胶质细胞炎症反应及对PC12细胞的影响。研究结果显示，0.5～10μmol/L姜黄素条件培养液组较鱼藤酮组PC12细胞活力明显增强，1.0μmol/L和5.0μmol/L的姜黄素条件培养液对PC12细胞活力影响最显著（P＜0.01）。因鱼藤酮是细胞线粒体复合物Ⅰ抑制剂，其抑制线粒体对氧的利用，从而产生大量ROS。另有文献［7］报道，鱼藤酮可激活BV-2细胞内NADPH氧化酶。因此，我们推测姜黄素可能通过直接清除BV-2细胞内ROS、抑制鱼藤酮诱导的BV-2细胞内NADPH氧化酶的激活抑制ROS的产生，从而发挥保护多巴胺细胞的作用。于是，我们测定了BV-2细胞内的ROS，结果显示，姜黄素明显减少了鱼藤酮诱导的BV-2细胞内的ROS的含量，以1.0μmol/L和5.0μmol/L姜黄素作用最强（P＜0.01）。我们分析，BV-2细胞内ROS的来源可能有：鱼藤酮抑制线粒体呼吸链利用氧而产生；通过NADPH氧化酶的激活途径产生；释放到BV-2细胞外的ROS向细胞内渗漏或通过胞吞作用进入细胞内。而BV-2细胞内ROS的增多又作为刺激因素激活NADPH氧化酶或促使BV-2细胞释放其他炎症介质［8］，进而形成恶性循环。为此，我们进一步检测了NADPH氧化酶的活性。结果显示，同NADPH氧化酶抑制剂apocynin一样，姜黄素也显著抑制了鱼藤酮诱导的BV-2胞质内p47phox亚基向细胞膜的转移，以5.0μmol/L姜黄素的作用最强（P＜0.01），从而减少BV-2细胞外和细胞内ROS的产生，保护多巴胺能细胞。

本研究证实，小胶质细胞介导的炎症反应加重了鱼藤酮对多巴胺能细胞的损伤；姜黄素通过抑制小胶质细胞NADPH氧化酶的激活，减少了小胶质细胞源性ROS的生成，及直接清除细胞内ROS，阻断小胶质细胞激活的恶性循环，从而保护多巴胺能细胞。

［1］Park JS，Shin JA，Jung JS，et al.Anti-inflammatory mechanism of compound K in activated microglia and its neuroprotective effect on experimental stroke in mice［J］.J Pharmacol Exp T-her，2012，341（1）：59-67.

［2］McGeer PL，McGeer EG.Glial reactions in Parkinson's disease［J］.Mov Disord，2008，23（4）：474-483.

［3］Karlstetter M，Lippe E，Walczak Y，et al.Curcumin is a potent modulator of microglial gene expression and migration［J］.J Neuroinflammation，2011，29（8）：125.

［4］Park HY，Park C，Hwang HJ，et al.7，8-Dihydroxyflavone attenuates the release of pro-inflammatory mediators and cytokines in lipopolysa-ccharide-stimulated BV2microglial cells through the suppression of the NF-KB and MAPK signaling pathways［J］.Int J Mol Med，2014，33（4）：1 027-1 034.

［5］Babior BM.Phagocytes and oxidative stress［J］.Am J Med，2000，109（1）：33-44.

［6］Zhang L，Wu C，Zhao S，et al.Demethoxycurcumin，a natural derivative of curcumin attenuates LPS-induced pro-inflammatory responses through down-regulation of intracellular ROS-related MAPK/NF-kap-paB signaling pathways in N9microglia induced by lipopolysaccha-ride［J］.Int Immunopharmacol，2010，10（3）：331-338.

［7］Gao HM，Zhou H，Zhang F，et al.Hmgb1acts on microglia mac1to mediate chronic neuroinflammation that drives progressive neurodegeneration［J］.J Neurosci，2011，31（3）：1 081-1 092.

［8］Zhang W，Dallas S，Zhang D，et al.Microglial PHOX and Mac-1 are essential to the enhanced dopaminergic neurodegeneration elicited by A30Pand A53Tmutant alpha-synuclein［J］.Glia，2007，55（11）：1 178-1 188.

（收稿2014-07-12）

R-332

A

1673-5110（2015）11-0037-03