胰岛素抑制Ⅰ型糖尿病模型大鼠脑斜角带核细胞凋亡及学习记忆障碍

王 薇郭 灵朱秀玲

（1皖南医学院解剖学教研室，芜湖 241002；2广西医科大学解剖学教研室，南宁 530021）

胰岛素抑制Ⅰ型糖尿病模型大鼠脑斜角带核细胞凋亡及学习记忆障碍

王 薇1郭 灵2*朱秀玲1

（1皖南医学院解剖学教研室，芜湖 241002；2广西医科大学解剖学教研室，南宁 530021）

目的 探索在胰岛素替代治疗下，Ⅰ型糖尿病模型大鼠基底前脑的斜角带核垂直支（VDB）、斜角带核水平支（HDB）凋亡基因 Bax与抗凋亡基因 Bcl-2表达、细胞凋亡、学习记忆的变化及其相互联系。方法 雄性 Wistar大鼠随机分成正常组、糖尿病组、胰岛素组、溶剂组。腹腔注射链脲佐菌素来建立Ⅰ型糖尿病模型；以 Morris水迷宫检测大鼠的空间记忆能力；免疫组织化学技术检测 Bax与Bcl-2的表达；TUNEL染色检测细胞凋亡。结果 糖尿病模型大鼠空间记忆能力显著低于正常大鼠；VDB和 HDB的Bax蛋白表达显著增加，而Bcl-2蛋白表达显著减少，细胞凋亡数明显增多；而胰岛素处理能显著改善糖尿病模型大鼠的空间记忆能力，翻转VDB和 HDB的 Bax蛋白及Bcl-2蛋白的异常表达，减少细胞凋亡。结论 胰岛素抑制Ⅰ型糖尿病模型大鼠模型大鼠脑斜角带核细胞凋亡并改善学习记忆障碍。

Ⅰ型糖尿病；胰岛素；糖尿病脑病；斜角带核；细胞凋亡；学习记忆

在糖尿病的发生或进展中，可影响到脑的某些正常结构与功能进而演变成为糖尿病脑病（diabetic encephalopathy）［1，2］。已有研究表明，与认知功能密切相关的胆碱能基底前脑是易受到该病累及的一个脑区，而且胆碱能神经元数量及其合成神经递质乙酰胆碱的潜能也受损，导致学习记忆障碍［3，4］。然而，有关这些病变的发生机制仍未十分清楚，细胞凋亡是否作为一种负性因素参与到其中迄今也仍未明确。为探索这方面的问题，本研究先建立Ⅰ型糖尿病大鼠模型并用胰岛素干预，测试学习记忆能力、检测基底前脑的斜角带核垂直支（vertical limb of diagonal band of Broca，VDB）和斜角带核水平支（horizontal limb of diagonal band of Broca，HDB）中凋亡因子Bax和抗凋亡因子 Bcl-2的蛋白表达水平，揭示胰岛素对其凋亡程度的影响，为糖尿病脑病发生机制的研究提供新线索。

材料和方法

1.材料

1.1 主要试剂和仪器

链脲佐菌素（STZ，Streptozotocin，美国Sigma公司）；兔抗大鼠 Bax和 Bcl-2多克隆抗体、SP免疫组化试剂盒、原位细胞凋亡检测试剂盒（TUNEL）及DAB显色液（北京中杉金桥生物技术有限公司）；鱼精蛋白长效锌胰岛素（江西万邦制药公司）；One touchⅡ血糖检测仪（美国强生公司）；Morris水迷宫（型号DMS-2，中国医学科学院药物研究所）；江湾I型C大鼠脑立体定位仪（上海川沙花木农机厂）。

1.2 实验动物与分组

将成年健康雄性Wistar大鼠（广西医科大学实验动物中心提供，体重180～220g，合格证号：SCXK桂2009-0002）32只随机分成4组，每组8只：糖尿病组、胰岛素组、溶剂组、正常组。

2.方法

2.1 动物模型的建立

按已报道的方法，先将STZ溶解于1ml pH4.4的柠檬酸缓冲液中，再将刚配制的STZ溶液按55mg／kg腹腔注射禁食24h后的大鼠，5d后尾静脉抽血测定空腹血糖，以血糖＞16.6mmol／L者作为成功的Ⅰ型糖尿病大鼠模型［5］。在相同条件下，对 8只溶剂组大鼠仅腹腔注射等量（1ml）的柠檬酸缓冲液。

2.2 干预措施

当确定成功建立Ⅰ型糖尿病大鼠模型后，将成模大鼠随机分成两组：胰岛素组和糖尿病组。胰岛素组干预措施：将鱼精蛋白长效锌胰岛素3 IU溶于0.5ml生理盐水中，每日定时（上午 9：00）对该组大鼠皮下注射胰岛素一次，使大鼠空腹血糖低于8.0mmol／L，连续注射60d；溶剂组干预措施：在相同时间和地点，对溶剂组大鼠每日皮下注射 0.5ml的生理盐水一次，连续注射60d；对正常组和糖尿病组大鼠不进行任何处理。

2.3 Morris水迷宫行为测试

按已报道的方法［5］，所有实验大鼠均在干预后第45d进行Morris水迷宫行为测试，分别测定逃避潜伏期和游泳距离。该实验历时5d，每天分上午、下午2个时间段，共10个时间段。前4.5d（前 9个时间段）测试逃避潜伏期，所有大鼠在每个时间段共被测试4次，测定在 2min内各组大鼠的逃避潜伏期（s），并以此作为判断大鼠空间学习能力的指标。在第5d下午（第10个时间段）撤走平台，测定大鼠入水后在2min内的全部游泳轨迹距离（cm），并以此作为判断大鼠空间记忆能力的指标。

2.4 免疫组织化学染色

按已报道的方法［5］，1%戊巴比妥钠（40mg／kg）腹腔麻醉大鼠，再经左心室-升主动脉先灌注生理盐水再灌注4%多聚甲醛溶液，开颅后将大鼠头部安置于脑立体定位仪上，参照大鼠脑立体定位图谱［6］，切取出含有全部斜角带核的脑组织块，后固定、脱水、透明、石蜡包埋。连续切片，片厚 5μm，常规脱蜡至水，分别进行 Bax、Bcl-2免疫组织化学染色反应及TUNEL染色反应。反应程序和显色步骤均按相关试剂的说明书进行；用磷酸缓冲盐溶液（pH7.4）代替一抗来进行阴性对照反应。常规脱水、透明、中性树胶封片，光镜下观察结果。

2.5 细胞计数

参照大鼠脑立体定位图谱［6］，以前囟前 0.48mm和前囟前0.20mm的脑冠状断面作为选择切片的坐标，对于每只大鼠的每一个指标，用光镜（10×40倍）观察以上每个断面的3张切片，并计数在 VDB或HDB境界内的4个视野（背侧、腹侧、内侧、外侧）的三类阳性细胞。大鼠基底前脑各核团冠状切面定位在光镜下的划分方法［7］是：经两侧前连合（ac）上缘及视神经（2n）背侧的脑腹侧沟顶端各作一条水平横线，在腹侧横线下方的区域为 HDB，在背侧、腹侧两条横线之间的地带则为VDB（图1）。

图1 大鼠基底前脑各核团冠状切面定位示意图Fig.1 Diagram showing localization of nuclei in the coronal plane of rat basal forebrain

2.6 统计分析

原始数据用 SPSS16.0统计软件中的单因素方差分析（one-way analysis of variance，one-way ANO-VA）进行分析，结果用（±s）表示；组间两两比较用 q检验。当 P＜0.05时差异具有统计学意义。

结 果

1.大鼠血糖水平的变化

与溶剂组比较，糖尿病组大鼠的血糖水平升高了241.03%，组间比较的差异有统计学意义（P＜0.01）；与胰岛素组比较，糖尿病组大鼠的血糖水平升高了216.99%，组间比较的差异有统计学意义（P＜0.01）；但溶剂组、胰岛素组、正常组的血糖水平彼此接近，三组之间的差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 各组大鼠空腹血糖水平的比较（（±s），n＝8）Table 1 Comparison of the fasting blood glucose levels of rats in each group（（±s），n＝8）

表1 各组大鼠空腹血糖水平的比较（（±s），n＝8）Table 1 Comparison of the fasting blood glucose levels of rats in each group（（±s），n＝8）

a与胰岛素组比较，P＜0.01；b与溶剂组比较，P＜0.01；c与正常组比较，P＜0.01acompared with insulin groups，P＜0.01；bcompared with vehicle groups，P＜0.01；ccompared with normal groups，P＜0.01

组别（Group）血糖水平（mmol／L）（the fasting blood glucose levels）糖尿病组（diabetes group） 19.78±2.83abc胰岛素组（insulin group） 6.24±2.26溶剂组（vehicle group）正常组（normal group）5.80±1.01 5.94±1.25

2.2 水迷宫行为测试

与溶剂组比较，糖尿病组的逃避潜伏期和游泳距离分别升高了99.03%和37.39%，组间比较的差异有统计学意义（P＜0.01）；与糖尿病组比较，胰岛素组的逃避潜伏期和游泳距离却分别下降了84.62%和29.76%，组间的差异有统计学意义（P＜0.01）。此外，胰岛素组的逃避潜伏期和游泳距离与溶剂组或正常组的结果十分接近，这三组之间的差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2 各组大鼠在水迷宫中的测试结果（（±s），n＝8）Table 2 Test results of water maze in each group rats（（±s），n＝8）

表2 各组大鼠在水迷宫中的测试结果（（±s），n＝8）Table 2 Test results of water maze in each group rats（（±s），n＝8）

a与胰岛素组比较，P＜0.01；b与溶剂组比较，P＜0.01；c与正常组比较，P＜0.01acompared with insulin groups，P＜0.01；bcompared with vehicle groups，P＜0.01；ccompared with normal groups，P＜0.01

组别（Groups）逃避潜伏期（s）（escape latency）游泳距离（cm）（swimming distance）糖尿病组（diabetes groups） 51.25±5.91abc 760.27±67.90abc胰岛素组（insulin groups） 27.76±4.89 585.91±55.97溶剂组（vehicle groups）正常组（normal groups）25.75±4.61 25.39±5.74 553.36±70.26 560.02±60.84

3.细胞凋亡的检测

在 VDB或 HDB中的 Bax、Bcl-2阳性细胞浆及TUNEL阳性细胞核均被染成棕黄色，但各组大鼠的这三类阳性细胞的形态均不发生明显变化；阴性对照反应的切片也不显色，呈阴性反应。（图4、图8）。

与溶剂组相比较，糖尿病组 VDB的Bax、TUNEL阳性细胞数分别比其升高了 153.89%和 68.15%，组间的差异有统计学意义（P＜0.01）；而且糖尿病组HDB的Bax、TUNEL阳性细胞数也分别比其升高了90.58%和67.07%，组间的差异具有统计学意义（P＜0.01），但糖尿病组的VDB、HDB的Bcl-2阳性细胞数则分别比溶剂组下降了39.95%和 43.31%，组间比较的差异具有统计学意义（P＜0.01）。与糖尿病组相比较，胰岛素组 VDB及 HDB的Bax、TUNEL和 Bcl-2阳性细胞数则发生了完全相反的显著变化，组间比较的差异均有统计学意义（P＜0.01），而且胰岛素组 VDB及 HDB的这三项指标与溶剂组的相近似，也可达到正常组的水平，组间比较的差异均无统计学意义（P＞0.05，图1-图3，图5-图7）。

图1 各组大鼠斜角带核垂直支Bax阳性细胞（免疫组织化学染色，400×）。a.糖尿病组；b.胰岛素组；c.溶剂组；d.正常组Fig.1 Bax immunoreactive cells in the vertical limb of diagonal band in each group of rats（ImmunohistoChemical staining，400×）.a.diabetes groups；b.insulin groups；c.vehicle groups；d.normal groups

图2 各组大鼠斜角带核垂直支Bcl-2阳性细胞（免疫组织化学染色400×）。a.糖尿病组；b.胰岛素组；c.溶剂组；d.正常组Fig.2 Bcl-2 immunoreactive cells in the vertical limb of diagonal band in each group of rats（ImmunohistoChemical staining 400×）. a.diabetes groups；b.insulin groups；c.vehicle groups；d.normal groups

图3 各组大鼠斜角带核垂直支 TUNEL阳性细胞（免疫组织化学染色400×）。a.糖尿病组；b.胰岛素组；c.溶剂组；d.正常组Fig.3 TUNEL immunoreactive cells in the vertical limb of diagonal band in each group of rats（ImmunohistoChemical staining 400×）. a.diabetes groups；b.insulin groups；c.vehicle groups；d.normal groups

图4 各组大鼠VDB的Bax、Bcl-2和TUNEL细胞凋亡检测结果比较。a与胰岛素组比较，P＜0.01；b与溶剂组比较，P＜0.01；c与正常组比较，P＜0.01Fig.4 The comparison of Bax、Bcl-2 and TUNEL apoptosis detection results in the vertical limb of diagonal band in each group of rats.acompared with insulin groups，P＜0.01；bcompared with vehicle groups，P＜0.01；ccompared with normal groups，P＜0.01

图5 各组大鼠斜角带核水平支Bax阳性细胞（免疫组织化学染色400×）。a.糖尿病组；b.胰岛素组；c.溶剂组；d.正常组Fig.5 Bax immunoreactive cells in the horizontal limb of diagonal band in each group of rats（ImmunohistoChemical staining 400×）. a.diabetes groups；b.insulin groups；c.vehicle groups；d.normal groups

图6 各组大鼠斜角带核水平支 Bcl-2阳性细胞（免疫组织化学染色400×）。a.糖尿病组；b.胰岛素组；c.溶剂组；d.正常组Fig.6 Bcl-2 immunoreactive cells in the horizontal limb of diagonal band in each group of rats（ImmunohistoChemical staining 400×）.a. diabetes groups；b.insulin groups；c.vehicle groups；d.normal groups

图7 各组大鼠斜角带核水平支TUNEL阳性细胞（免疫组织化学染色400×）。a.糖尿病组；b.胰岛素组；c.溶剂组；d.正常组Fig.7 TUNEL immunoreactive cells in the horizontal limb of diagonal band in each group of rats（ImmunohistoChemical staining 400 ×）.a.diabetes groups；b.insulin groups；c.vehicle groups；d.normal groups

图8 各组大鼠HDB的Bax、Bcl-2和TUNEL细胞凋亡检测结果比较。a与胰岛素组比较，P＜0.01；b与溶剂组比较，P＜0.01；c与正常组比较，P＜0.01Fig.8 The comparison of Bax、Bcl-2 and TUNEL apoptosis detection results in the horizontal limb of diagonal band in each group of rats.acompared with insulin groups，P＜0.01；bcompared with vehicle groups，P＜0.01；ccompared with normal groups，P＜0.01

讨 论

基底前脑的斜角带核内含有大量的胆碱能神经元，并可分为 VDB和HDB。VDB的胆碱能神经元发出纤维投射到海马，组成 VDB-海马通路，参与空间学习和记忆过程［3］；而 HDB的胆碱能神经元发出的纤维投射终止于嗅球，构成 HDB-嗅球通路，参与嗅觉学习记忆过程［4］。研究证实，糖尿病可引起基底前脑的胆碱能神经元数量减少及乙酰胆碱合成酶表达水平明显下降，且引发学习记忆障碍［3，4］，但目前仍未完全清楚发生这些异常变化的缘由。

Bax与 Bcl-2分别是 Bcl-2基因家族中作用相互对立的重要凋亡调控基因，前者为促凋亡基因，后者为抗凋亡基因，这两个基因表达产物水平的比值变化，将决定着病变部位的细胞是否进入凋亡门坎及发生凋亡事件，因此通过检测 Bax与 Bcl-2的表达产物可评判某部位发生细胞凋亡的趋势；而在判定已发生细胞凋亡事件的结局方面，则用TUNEL方法来检测［8，9］。此外，细胞凋亡已成为一种公认的机制在多种脑病变的发生和归转中施加相应的影响［10］，我们推测，促凋亡基因 Bax和抗凋亡基因 Bcl-2的蛋白表达变化及出现细胞凋亡事件，可能参与了上述病理过程。为证实这一假说，本研究先用链脲佐菌素建立Ⅰ型糖尿病大鼠模型，并以空腹大鼠尾静脉的血糖水平作为依据判定成功建模的前提下，观察上述各项指标的变化，所得结果显示：与溶剂组或正常组大鼠相比较，糖尿病组大鼠VDB及HDB的Bax、TUNEL阳性细胞数均明显升高，而 Bcl-2阳性细胞数和学习记忆能力则明显下降；胰岛素组大鼠 VDB及 HDB的 Bax、Bcl-2、TUNEL阳性细胞数及学习记忆能力与糖尿病组大鼠相比较，却发生了完全相反的显著变化，但这四项指标值均可恢复到正常水平。本研究的这些结果与 其他 学 者 所 报 道 的基 本 一致［11，12］，说 明Ⅰ型糖尿病能促进细胞凋亡的发生，胰岛素则有遏制细胞凋亡的功效。

我们的结果提示：Ⅰ型糖尿病的低胰岛素或高血糖诱因促进细胞启开了凋亡程序，使VDB及HDB的 Bax蛋白表达上调，而 Bcl-2蛋白表达则下调，造成这两种蛋白原来正常比例的产物量发生了变化，这将驱使细胞接受指令而自动进入到凋亡状态，故VDB及 HDB的胆碱能神经元在总体上发生了过度凋亡，使神经元数量减少、神经递质乙酰胆碱的合成酶的表达水平下降，不能合成及释放足够量的乙酰胆碱，导致神经冲动在由 VDB或 HDB朝向靶区传导的通路中发生故障，最终引起学习记忆能力下降［13］；在胰岛素替代治疗后，可消除上述细胞凋亡程序的诱因，纠正基底前脑 Bax与 Bcl-2蛋白异常表达，将濒临凋亡的神经元拯救回来，恢复了胆碱能神经元的数量以及神经递质的正常代谢和应有效应，进而消除学习记忆障碍。

虽然本研究揭示了胰岛素干预前后糖尿病大鼠基底前脑Bax蛋白、Bcl-2蛋白、TUNEL阳性细胞（凋亡的细胞）、学习记忆四个指标变化的相互关系，并初步得出以下结论：基底前脑发生过度细胞凋亡，可能是胆碱能神经元遭受损害易患糖尿病脑病的一个负性因素，但在患Ⅰ型糖尿病的状态下，有关 Bax蛋白与 Bcl-2蛋白相互作用的具体模式，Bax或 Bcl-2上游、下游的相关信号转导路径或分子仍未清楚，尚需进一步研究来澄清。

综上所述，糖尿病可能通过细胞凋亡信号转导途径累及胆碱能基底前脑，导致学习记忆障碍，诱发糖尿病脑病；而胰岛素则可通过抗细胞凋亡信号转导途径保护胆碱能基底前脑，矫正学习记忆障碍，避免糖尿病脑病的发生。由此也提示，在临床上应尽早诊断Ⅰ型糖尿病，及时用胰岛素来针对性治疗，才能有效防止Ⅰ型糖尿病脑病的发生。

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InsulinInhibits Cell Apoptosis in the Diagonal Band of Broca and Cognitive Impairment of Streptozotocin-induced Type 1 Diabetes Rats

Wang Wei1，Guo Ling2*，Zhu Xiuling1
（1Department of Anatomy，Wannan Medical College，Wuhu 241002；2Department of Anatomy，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China）

Objective To explore the effects of insulin therapy on impairments of learning and memory，on cell apoptosis，and on Bax or Bcl-2 protein expression in the diagonal band of Broca（vertical limb of diagonal band，VDB；horizontal limb of diagonal band，HDB）of rats with type 1 diabetes.Methods Male Wistar rats were randomly divided into four groups：normal，diabetes，insulin，and vehicle.Type 1 diabetes rat model was established by a dosage of intraperitoneal injection of streptozotocin.Morris water maze was used to investigate spatial memory ability.Immunohistochemistry was used to investigate protein expression of Bax and Bcl-2.Terminal-deoxynucleotidy-transferase-mediated-dUTP nick and labeling（TUNEL）was used to investigate cell apoptosis.Results The spatial memory abilities of rats in the type 1 diabetes group was significantly worse than that of normal rats.The protein expression of Bax in VDB or HDB was significantly increased；while the protein expression of Bcl-2 significantly decreased.However，insulin treatment significantly improved the spatial memory abilities of diabetic rats，reversed the abnormal protein expression of Bax and Bcl-2 in VDB and HDB，and reduced cell apoptosis.Conclusion Insulin can inhibit cell apoptosis in the diagonal band of Broca and cognitive impairment of streptozotocin-induced type 1 diabetes.

Type 1 diabetes；Insulin；Diabetic Encephalopathy；Diagonal band of Broca；Cell apoptosis；Cognitive ability

Q427；Q255

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.011

2015-04-20

2015-08-13

皖南医学院中青年科研基金资助（WK201108）；广西高校自然科学基金资助（201012MS035）；重大教学改革研究项目（2014zdjy078）；安徽省高等学校优秀人才基金项目（2012SQRL120ZD）

王薇，女（1985年），汉族，助教

*通讯作者（To whom correspondence should be addressed）drguolinggx＠aliyun.com