CD44＋／CD24－和 CK5／6在乳腺浸润性导管癌、乳腺普通型导管增生和低级别导管原位癌中的表达

王星星 胡 勇夏国栋 李梦君

（解放军第105医院病理科，合肥 230031）

CD44＋／CD24－和 CK5／6在乳腺浸润性导管癌、乳腺普通型导管增生和低级别导管原位癌中的表达

王星星 胡 勇*夏国栋 李梦君

（解放军第105医院病理科，合肥 230031）

目的 探讨乳腺浸润性导管癌、普通型导管增生和低级别导管原位癌组织中CD44＋／CD24－和 CK5／6的表达和意义。方法 采用免疫组织化学染色检测30例乳腺浸润性导管癌中CD44＋／CD24－、CK5／6和 P63的表达、30例乳腺普通型导管增生组织中 CD44＋／CD24－、CK5／6、34βE12和 CK8的表达和30例低级别导管原位癌中 CD44＋／CD24－、CK5／6的表达。结果 30例乳腺浸润性导管癌中24例呈CD44＋／CD24－，30例普通型导管增生中9例呈 CD44＋／CD24－和30例低级别导管原位癌中19例呈 CD44＋／CD24－，3组相比具有统计学意义。浸润性导管癌中CD44＋／CD24－表型与患者的年龄、月经状况、肿瘤大小、淋巴结转移、组织学分级、ER、PR和HER－2无相关性。30例乳腺浸润性导管癌中6例表达CK5／6，30例乳腺普通型导管增生中全部表达 CK5／6，30例低级别导管原位癌中 8例表达CK5／6，3组相比具有统计学意义。结论 CD44＋／CD24－和CK5／6联合使用可用于鉴别乳腺浸润性导管癌、普通型导管增生和低级别导管原位癌。

浸润性导管癌；普通型导管增生；低级别导管原位癌；CD44＋／CD24－；CK5／6

乳腺癌是一类在分子水平上高度异质性的恶性肿瘤，无论在组织形态、免疫表型、生物学行为还是治疗反应上都存在极大的差异。其中，以浸润性导管癌（invasive ductal carcinoma，IDC）最为常见。其在形态学上多表现为管状、索条状结构，部分呈巢状和实体状。乳腺普通型导管增生（usual ductal hyperplasia，UDH）是一种良性导管型增生病变或一种定向干细胞病变。增生的细胞多种多样，彼此间相互黏附，有的甚至形成增生的细胞团，呈实体状充填闭塞固有管腔。而低级别导管原位癌 （low grade DCIS）是一种肿瘤性的导管内病变，其特征为导管型肿瘤性上皮细胞增生明显，细胞形态单一，大小一致，轻度异型，未突破导管基膜，无间质浸润。这样，就使得在临床工作中鉴别 IDC、UDH和低级别 DCIS尤为重要。本文选择30例IDC、30例UDH和30例低级别DCIS病例，分别行免疫组化双染CD44和CD24，单染 CK5／6、p63和 34βE12等抗体，分析了 CD44＋／CD24－和 CK5／6在三种病变中的表达和意义。

材料和方法

1.材料

收集解放军第105医院2008年1月 ～2013年1月乳腺 IDC蜡块30例，所有乳腺癌患者均未行放疗和化疗，年龄 39岁 －67岁，中位年龄 50.2岁，其中，≥50岁者13例，＜50岁17例，≥2枚淋巴结转移者16例，＜2枚淋巴结转移者14例。肿瘤直径≤2.0cm 7例，＞2.0cm 23例。组织学分级：Ⅰ～Ⅱ级17例，Ⅲ级13例。收集乳腺UDH蜡块30例，年龄20岁 －76岁，中位年龄43.4岁。收集低级别DCIS蜡块30例，年龄28－63岁，中位年龄39.2岁。

2.试剂

鼠抗人单克隆抗体CD44（克隆号156-3C11）购自Thermo公司，工作浓度 1：100；鼠抗人单克隆抗体CD24（克隆号SN3b）购自NeoMarkers公司，工作浓度1：50；即用型鼠抗人单克隆抗体 CK5／6（克隆号D5／16B4）、CK8（克隆号TS1）、CK（克隆号34βE12）、P63（克隆号4A4）、ER（克隆号SP1）、PR（克隆号SP2）和HER-2（克隆号 SP3）均购自福州迈新公司；SP免疫组化双染试剂盒购自福州迈新公司。

3.方法

对收集的所有蜡块切片行 HE染色。对IDC的蜡块行免疫组织化学单染 CK5／6、P63、ER、PR和HER-2，并双染CD44和CD24；对乳腺UDH的蜡块行免疫组织化学单染 CK5／6、CK8和 34βE12，并双染CD44和CD24；对低级别DCIS的蜡块行免疫组织化学单染CK5／6，双染CD44和CD24。用PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照，为保证双染结果的可靠性，每一批实验均进行单染作对照。

4.结果判读

4.1 HE染色

对IDC、UDH和低级别DCIS蜡块进行 HE染色和病理诊断，并对IDC行组织学Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分级。

4.2 免疫组织化学染色

CD44和 CD24：CD44染色结果细胞膜呈红色为阳性，CD24染色结果以细胞质和（或）胞膜呈蓝黑色为阳性。双染结果显示细胞膜呈红色，胞质或胞膜无蓝黑色干扰的肿瘤细胞判定为 CD44＋／CD24－细胞。由两位高年资病理医师采用双盲法阅片，CD44＋／CD24－细胞在肿瘤组织中比例均以≥1%为阳性，其中阳性细胞介于1～10%为 ＋（1分），阳性细胞介于11～50%为 ＋＋（2分），阳性细胞介于51～75%为 ＋＋＋（3分），阳性细胞介于 76～100%为＋＋＋＋（4分）［1］。ER和 PR：阳性细胞着色定位于细胞核，切片中阳性细胞≥15%为阳性（＋）［2］。HER-2：阳性细胞着色定位于细胞膜。0：无染色或≤10%的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色；1＋：＞10%的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色；2＋：有两种情况，第一种为 ＞10%的浸润癌细胞呈现不完整和／或弱至中等强度的细胞膜染色，第二种为≤10%的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色；3＋：＞10%的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色［3］。CK5／6、CK8和34βE12：阳性细胞着色定位于细胞质，呈棕黄色。P63：阳性细胞着色定位于细胞核，呈棕黄色。

5.统计学处理

所有数据均采用 SPSS13.0进行统计学分析，采用 χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1.CD44＋／CD24－表型在乳腺浸润性导管癌、乳腺普通型导管增生和低级别导管原位癌中的表达

30例IDC中24例呈CD44＋／CD24－（图1a），占80%，其中 ＋、＋＋、＋＋＋和 ＋＋＋＋的分别为14例（46.7%）、6例（20%）、2例（6.7%）和 2例（6.7%）；30例 UDH中 9例呈 CD44＋／CD24－，占30%，且均为 ＋（图1b）（表1）；30例低级别DCIS中19例呈CD44＋／CD24－（图1c），占63%。IDC组与UDH组相比，具有统计学意义（P＝0.000）；UDH组与低级别 DCIS组相比，具有统计学意义（P＜0.05）。

2.CK5／6在乳腺浸润性导管癌和乳腺普通型导管增生中的表达

30例IDC中6例表达CK5／6（图2a），占20%，此6例浸润性导管癌P63均为阴性表达（图2b），确信其为非肌上皮来源；同时分析ER、PR和HER-2状态，发现此6例病例均为 ER、PR、HER-2阴性表达，故此6例乳腺癌病例可归为基底细胞样乳腺癌。30例UDH中均表达CK5／6（表2），且与34βE12和CK8形成特征性的“镶嵌式”表达（图3A～D）。30例低级别导管原位癌中 8例表达 CK5／6（图4）。UDH组和IDC组相比，UDH组与低级别 DCIS组相比，均具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 CD44＋／CD24－表型在乳腺浸润性导管癌、乳腺普通型导管增生和低级别导管内癌中的表达。A.乳腺浸润性导管癌高呈 CD44＋／CD24－（400×）；B.乳腺普通型导管增生中少数细胞呈CD44＋／CD24－（400×）；C.低级别导管原位癌中部分细胞呈CD44＋／CD24－（400×）Fig.1 the expression of CD44＋／CD24－in IDC group and UDH group.A.a strong expression of CD44＋／CD24－in IDC（400×）；B.a few cells express CD44＋／CD24－in UDH（400×）；C.some cells express CD44＋／CD24－in low grade DCIS（400×）

图2 CK5／6和P63在乳腺浸润性导管癌中的表达。A.浸润性导管癌表达 CK5／6（200×）；B.浸润性导管癌P63显示肌上皮缺失（200×）Fig.2 the expression of CK5／6 and P63 in IDC.A.the expression of CK5／6 in IDC（200×）；B.staining of P63 demonstrate the lack of myoepithelial in IDC（200×）

表 1 CD44＋／CD24－表型在乳腺浸润性导管癌、乳腺普通型导管增生和低级别导管原位癌中的表达Table 1 The expression of CD44＋／CD24－in IDC group，UDH group and low grade DCIS group

3.乳腺浸润性导管癌 CD44＋／CD24－表型与临床病理资料的关系

30例 IDC中，CD44＋／CD24－表型与患者的年龄、月经状况、肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移、ER、PR和HER-2等均无相关性（P＞0.05）（表3）。

图3 CK5／6、34βE12和CK8在乳腺普通型导管增生中形成“插花样”表达及CD44＋／CD24－表型在乳腺普通型导管增生中的阴性表达。A.乳腺普通型导管增生（HE400×）；B.乳腺普通型导管增生 CK5／6阳性表达（400×）；C.乳腺普通型导管增生 34βE12阳性表达（400×）；D.乳腺普通型导管增生 CK8阳性表达 （400×）Fig.3 the expression of CK5／6、34βE12 and CK8 display“figure Inserting”pattern in UDH and the negative expression of CD44＋／CD24－in UDH.a.UDH（HE400×）；b.the expression of CK5／6 in UDH（400×）；c.the expression of 34βE12 in UDH（400×）；d. the expression of CK8 in UDH（400×）

图4 低级别导管原位癌 CK5／6阳性表达 （×200）Fig.4 the expression of CK5／6 in low grade DCIS（×200）

表2 CK5／6在乳腺浸润性导管癌、乳腺普通型导管增生和低级别导管原位癌中的表达Table 2 The expression of CK5／6 in invasive ductal carcinoma group，usual ductal hyperplasia group and low grade DCIS group

表 3 乳腺浸润性导管癌 CD44＋／CD24－表型与临床病理资料的关系Table 3 The relationship between CD44＋／CD24－phenotype and clinical characteristics in IDC

讨 论

1.CD44＋／CD24－表型与乳腺癌干细胞

肿瘤干细胞是既具有肿瘤细胞的特征又具有干细胞的特征的一群细胞，其生物学特征表现为自我更新性、高致瘤性，并具有分化潜能和抵抗放化疗的能力［4］。肿瘤干细胞具有不同的分子标记物。近年来，研究者提出使用分子标记物 CD44＋／CD24－、ALDH1和CD133等进行乳腺癌干细胞的分选［5］。其中，CD44＋／CD24－是目前乳腺癌干细胞公认的表面分子标记物。2003年，AI-HAJJ用 NOD／SCID小鼠研究乳腺癌时发现，仅用100个免疫表型为 CD44＋／CD24－、Lineage-的肿瘤细胞，就能在 NOD／SCID小鼠体内形成肿瘤，而数百万个不具有此表型的非肿瘤干细胞却不能形成肿瘤［6］。本研究中，乳腺 IDC中 CD44＋／CD24－表型占 80%，其评分分别为 ＋（14例）、＋＋（6例）、＋＋＋（2例）和 ＋＋＋＋（2例），低级别DCIS中CD44＋／CD24－表型占63%，而UDH中CD44＋／CD24－表型仅占30%，这提示乳腺UDH、低级别 DCIS和 IDC中均存在CD44＋／CD24－的乳腺癌干细胞，且随着乳腺良性病变向恶性病变的发展，其组织内表达CD44＋／CD24－的乳腺癌干细胞也随之增加。Dittmer［7］的研究指出：乳腺癌干细胞的起源有二：其一，正常干／祖细胞原本严密受控的自我更新能力调控失常；其二，乳腺不同类型细胞连续遗传突变过程去分化，成为肿瘤干细胞。本研究中，UDH、低级别 DCIS和IDC中均出现了癌干细胞标记物CD44＋／CD24－的表达，证明了乳腺癌干细胞起源于正常干／祖细胞的自我更新能力的调控失常；比较三组病变，不难发现，乳腺浸润性导管癌中癌干细胞标记物 CD44＋／CD24－的表达率较高，且评分较高，这也进一步说明，乳腺癌的发生可能与乳腺不同类型细胞连续遗传突变为乳腺癌干细胞有关。

2.CD44＋／CD24－表型与乳腺癌各临床病理特征的关系

CD44是分布在细胞膜的糖蛋白，可能通过与透明质酸的结合促进肿瘤细胞与血管内皮细胞的黏附作用，从而增加癌肿侵袭性［8］。CD24也是分布在细胞膜表面的糖蛋白，其作为一种细胞黏附分子，通过与配体 P-选择素结合介导了肿瘤细胞的远处转移［9］。Abraham等［10］应用免疫组织化学技术回顾性分析了肿瘤组织中CD44＋／CD24－细胞的比例，发现CD44＋／CD24－细胞占肿瘤组织比例为 0～80%，但78%患者中CD44＋／CD24－的细胞比例 ＜10%，未发现与组织病理学特征有关，但可能与骨转移有关。Tiezzi等［11］的研究发现，浸润性导管癌中 CD44＋／CD24－的表达与患者的年龄、临床病理分期、组织学分级和 HER-2的表达无关，但与患者的淋巴结转移相关。本研究中，CD44＋／CD24－细胞占肿瘤组织的0～90%（＋～＋＋＋＋），未发现CD44＋／CD24－的表达与患者年龄、组织学分级和 HER-2相关，与Abraham等和 Tiezzi等的报道大致吻合。

3.CK5／6与乳腺前体细胞

人类乳腺组织含有 2种不同的上皮细胞：腺腔内层的腺上皮细胞和外层的肌上皮细胞。Boecker等［12］的研究表明，乳腺腺上皮和肌上皮细胞具有共同的祖细胞（progenitor cell），即定向干细胞（progenitor stem cell），表达CK5（CK5／6）。这种定向干细胞可沿着腺系、经腺中间细胞分化为腺终端细胞，也可沿着肌上皮系、经肌上皮中间细胞分化为肌上皮终端细胞。也就是说，正常乳腺组织存在以下 5种细胞成分：①定向干细胞（祖细胞），CK5＋或CK5／6＋；②腺上皮中间细胞，也称腺前驱细胞，CK5＋、CK8／18／19＋，也表达 CK1／5／10／14（克 隆 号34βE12）；③腺终末细胞，CK8／18／19＋；④肌上皮中间细胞，也称肌上皮前驱细胞，CK5（CK5／6）＋和SMA＋，⑤肌上皮终末细胞，SMA＋。在乳腺干细胞的分化过程中，起始表达 CK5（CK5／6）的定向干细胞逐渐获得CK8／18／19和SMA的表达，并逐渐丢失 CK5／6的表达，最终成为腺终末细胞和肌上皮终末细胞。按照“乳腺普通型导管增生是一种定向干细胞病变”的观点［13］，普通型导管增生灶内可出现多种细胞的表达，如 CK5／6＋的乳腺定向干细胞、34βE12＋的腺中间细胞和CK8＋的腺终端细胞，它们在UDH病灶内镶嵌式排列，构成 UDH特征性的免疫表型，具有诊断意义［14，15］。

本研究中，30例UDH均出现了CK5／6、34βE12和 CK8的镶嵌式表达，与国内外文献报道相吻合。30例IDC中，6例表达CK5／6（占20%），进一步的研究发现，其ER、PR和 HER-2的免疫表型均为阴性，因此，可归类为基底细胞样乳腺癌。有文献报道，基底细胞样乳腺癌来源于乳腺干细胞，其具有较高的增殖活性和高度侵袭性，易于复发和转移。

4.CD44＋／CD24－和 CK5／6在鉴别 UDH、低级别DCIS和 IDC中的作用

临床工作中，病理医师经常遇到鉴别UDH、低级别 DCIS和 IDC的情况，特别是当普通型导管增生的细胞较多，填塞整个管腔时，呈实性生长时，此时借助于免疫组化鉴别 UDH、低级别 DCIS抑或 IDC尤为重要。本研究中使用标记物CD44、CD24和CK5／6进行鉴别，同时，辅以抗体p63、CK8和 34βE12。若病变细胞表达乳腺癌干细胞的标记物 CD44＋／CD24－，同时乳腺干细胞的标记物CK5／6阴性（或阳性）时，要考虑浸润性导管癌或低级别导管原位癌的诊断；若病变内细胞表达乳腺干细胞标记物 CK5／6，同时，乳腺癌干细胞的标记物 CD44＋／CD24－不表达（或少有表达）时，考虑为UDH的诊断，此时，应注意观察CD44＋／CD24－的表达细胞数是否小于10%，是否出现了 UDH的特征性镶嵌式（CK5／6、CK8和34βE12的）表达。综上所述，乳腺干细胞标记物CK5／6和乳腺癌干细胞的标记物 CD44＋／CD24－及其它抗体（如 P63、34βE12和CK8等）的应用，可以用来鉴别乳腺良恶性病变。在实际工作中需要积累更多的病例以进一步探讨这一问题。

［1］Honeth G，Bendahl PO，Ringnér M，et al.TheCD44＋／CD24－phonotype is enriched in basal-like breast tumors. Breast Cancer Res，2008，10（3）：R53

［2］Ailles LE，Weissman IL.Cancerstem cellsin solid tumors.Curr Opin Biotechnol，2007，18（50）：460-466

［3］《乳腺癌HER2检测指南（2014版）》编写组.乳腺癌HER2检测指南（2014版）.中华病理学杂，2014，43（4）：262-267

［4］何 惠 华，杨 继洲，李 蓓，等.三 阴 乳 腺癌 CD44＋／CD24（-／LOW）细胞与 CXCR4表达的临床意义.中国组织化学与细胞化学杂志，2014，23（2）：190-194

［5］Wright MH，Calcagno AM，Salcido CD，et al.Brca1 breast tumors contain distinct CD44＋／CD24-and CD133＋cells with cancer stem cell characteristics.Breast Cancer Res，2008，10（1）：R10

［6］Al-Hajj M，Wicha MS，Benito-Hernandez A，et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.Proc Natl Acad Sci U S A.2003，100（7）：3983-3988

［7］Dittmer J，Rody A.Cancer stem cells in breast cancer.Histopathol，2013，28（7）：827-838

［8］Babina IS，McSherry EA，Donatello S，et al.A novel mechanism of regulating breast cancer cell migration via palmitoylation-dependent alterations in the lipid raft affiliation of CD44.Breast Cancer Res.2014，16（1）：R19

［9］Adamczyk A，Niemiec JA，Ambicka A，et al.CD44／CD24 as potential prognostic markers in node-positive invasive ductal breast cancer patients treated with adjuvant chemotherapy.J Mol Histol，2014，45（1）：35-45

［10］Abraham BK，Fritz P，McClellan M，et al.Prevalence of CD44＋／CD24-／low cells in breast cancer may not be associated with clinical outcome but may favor distant metastasis.Clin Cancer Res，2005，11（3）：1154-1159

［11］Tiezzi DG1，Valejo FA，Marana HR，et al.CD44＋／CD24-cells and lymph node metastasis in stage I and II invasive ductal carcinoma of the breast.Med Oncol，2012，29（3）：1479-1485

［12］Böcker W，Moll R，Poremba C，et al.Common adult stem cells in the human breast give rise to glandular and myoepithelial cell lineages：a new cell biological concept.Lab Invest，2002，82（6）：737-746

［13］Boecker W，Buerger H，Schmitz K，et al.Ductal epithelial proliferations of the breast：a biological continuum？Comparative genomic hybridization and high-molecular-weight cytokeratin expression patterns.J Pathol，2001，195（4）：415-421

［14］龚西騟，丁华野.乳腺病理学.北京：人民卫生出版社，2009，221-233

［15］黄受方.乳腺 “干细胞 （CK5／6＾＋）学说”与导管上皮良恶性增生的诊断.中华病理学杂志，2013，42（2）：73-77

Expression of CD44＋／CD24-and CK5／6 in invasive breast cancer，
usual ductal hyperplasia and low grade ductal carcinoma in situ

Wang Xingxing，Hu Yong*，Xia guodong，Li Mengjun
（Department of Pathology，the 105th hospital of PLA，Hefei 230031，China）

Objectives To explore the expression and significance of CD44＋／CD24－and CK5／6 in invasive ductal breastc arcinoma，usual ductal hyperplasia and low grade ductal carcinoma in situ.Methods Double immunohistochemical staining of CD44／CD24 was performed in 30 cases of invasive ductal carcinoma，30 cases of usual ductal hyperplasia and 30 cases of low grade ductal carcinoma in situ.Meanwhile，single immunohistochemical staining of CK5／6 and P63 was performed in invasive ductal carcinoma，single immunohistochemical staining of CK5／6，34βE12 and CK8 in usual ductal hyperplasia，and single immunohistochemical staining of CK5／6 in low grade ductal carcinoma in situ.Results 24，9，and 19 cases of CD44＋／CD24－phenotype were detected in invasive ductal carcinoma，usual ductal hyperplasia and low grade ductal carcinoma in situ，respectively.There were significant differences among the 3 groups.No significant correlation was found between the CD44＋／CD24－phenotype and patients’age，menstruation state，tumour size，lymph node metastasis，histological grade，ER，PR and HER－2.6 cases of invasive ductal carcinoma，totally 30 cases of usual ductal hyperplasia and 8 cases of low grade ductal carcinoma in situ were CK5／6 positive.Significant differences were observed among the 3 groups.Conclusion CD44＋／CD24－and CK5／6 can be used in combination to diagnose invasive ductal carcinoma，usual ductal hyperplasia and low grade ductal carcinoma in situ.

Invasive ductal carcinoma；Usual ductal hyperplasia；Low grade ductal carcinoma in situ；CD44＋／CD24－；CK5／6

R737.9

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.008

2015-05-25

2015-08-28

解放军105医院科研基金（2012YG10）

王星星，女（1974年），汉族，硕士

*通讯作者（To whom correspondence should be addressed）：huyong105＠126.com