TBX2和 PAX9在膀胱尿路上皮癌中高表达

陕 光 钱辉军 夏 樾

（武汉大学人民医院泌尿Ⅱ科，武汉 430060）

TBX2和 PAX9在膀胱尿路上皮癌中高表达

陕 光 钱辉军 夏 樾

（武汉大学人民医院泌尿Ⅱ科，武汉 430060）

目的 研究 TBX2和 PAX9在膀胱尿路上皮癌中的表达及临床意义。方法 收集武汉大学人民医院病理科2006-2009年有完整临床和病理资料的膀胱尿路上皮癌存档蜡块50例和5例癌旁组织，采用免疫组织化学 S-P法检测50例膀胱尿路上皮癌和5例癌旁组织中 TBX2和 PAX9的表达水平；采用 HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统，对TBX2和 PAX9的表达进行定量分析，并用 SPSS13.0软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK（q）检验。结果 TBX2和PAX9在膀胱尿路上皮癌中均高表达，与癌旁组织相比，差异有显著性；经Spearman等级相关分析显示，TBX2和 PAX9表达呈正相关。结论 TBX2和 PAX9对膀胱尿路上皮癌诊断提供参考价值。

膀胱尿路上皮癌；TBX2；PAX9；免疫组织化学

膀胱尿路上皮癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。膀胱尿路上皮癌占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位，而在西方其发病率仅次于前列腺癌，居第二位［1］。膀胱尿路上皮癌可发生于任何年龄，甚至儿童。其发病率随年龄增长而增加，高发年龄50～70岁。男性膀胱尿路上皮癌发病率为女性的3～4倍［2］。膀胱尿路上皮癌的病因复杂，既有内在的遗传因素，又有外在的环境因素，其发病原因还不清楚。因此，研究与膀胱癌发生发展的分子生物学机理，寻找早期预测膀胱癌发生发展的分子生物学标记物，为膀胱癌的发生和复发的预测提供一定的参考依据具有重要的临床意义。

TBX2是T-BOX基因家族成员之一，属于发育调控相关转录因子基因［3］；PAX9为 PAX家族的新成员，是胚胎发育过程中不可或缺的调控基因。有研究发现 TBX2、PAX9在多种肿瘤中表达上调，可视为新的肿瘤标志物［4-5］。

采用免疫组化和图像分析方法检测和分析膀胱尿路上皮癌组织 TBX2和 PAX9的表达，以期能进一步探讨膀胱尿路上皮癌发生发展的分子生物学机理，为膀胱尿路上皮癌的诊治提供理论依据。

材料和方法

1.材料

收集武汉大学人民医院病理科2006-2009年膀胱尿路上皮癌存档蜡块50例（均经病理学证实为膀胱尿路上皮癌），其中男性38例，女性12例，平均年龄50.3岁，另 5例癌旁组织距瘤缘 3～5cm。标本均经 HE染色，光镜观察诊断，按WHO尿路肿瘤组织学分类（2004），浸润性尿路上皮癌30例，非浸润性乳头状尿路上皮癌；高级别15例，低级别5例；按UICC临床分期，T1 31例，T2 11例，T3～4 8例。其中未经化疗的初发肿瘤 28例，化疗后复发肿瘤22例。

2.主要试剂

即用型兔抗人TBX2和 PAX9多克隆抗体 （北京中杉生物技术有限公司）；超敏即用型 SP通用型免疫组织化学试剂盒（北京中杉生物技术有限公司）；DAB显色试盒及多聚赖氨酸（北京中杉生物技术有限公司）。

3.方法

3.1 HE染色

常规取材、固定、脱水、透明、包埋、切片、HE染色及封片

3.2 免疫组织化学染色

组织切片常规脱蜡至水后，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗 3×3 min；抗原修复，室温自然冷却后，PBS漂洗5×3 min；滴加3%过氧化氢，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS漂洗3×3 min；正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景；甩去多余血清，分别滴加一抗，4℃孵育过夜，PBS漂洗3×5 min；滴加生物素标记的二抗37℃湿盒孵育10min，PBS漂洗 3×3 min；滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物复合物 37℃湿盒孵育10min，PBS漂洗3×3 min；滴加新鲜配置的DAB显色液显色，光镜下控制反应时间（约3～5 min），自来水冲洗终止反应；苏木素复染，流水冲洗，1%盐酸酒精分色数秒，流水冲洗，0.1%氨水返蓝；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检；用 PBS代替一抗作为阴性对照组，购买的阳性片作为 TBX2和PAX9的阳性对照组。

3.3 免疫组织化学结果判断

TBX2和 PAX9以细胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应，阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。

4.统计学分析

采用 HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对 TBX2和 PAX9的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（400×），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。（阳性面积率 ＝单位面积中阳性反应的总面积／单位面积中细胞的总面积×100%）

对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和q检验，检验水准 α为0.05。相关性分析采用Spearman等级相关分析，P＜0.05差异有统计学意义。

结 果

1.TBX2的表达

膀胱尿路上皮癌细胞内可见密集分布的棕黄色颗粒，TBX2表达呈阳性（图1A）；癌旁组织细胞内可见极少量的或无棕黄色颗粒，TBX2表达呈阴性（图1B）。图像分析结果见表1。经q检验，膀胱尿路上皮癌与癌旁组织之间，TBX2的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（P＜0.05）（表1）。

2.PAX9的表达

膀胱尿路上皮癌细胞内可见密集分布的棕黄色颗粒，PAX9表达呈阳性（图1C）；癌旁组织细胞内可见极少量的或无棕黄色颗粒，PAX9表达呈阴性（图1D）。图像分析结果见表2。经 q检验，膀胱尿路上皮癌与癌旁组织之间，PAX9的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（P＜0.05）（表2）。

表1 膀胱尿路上皮癌和癌旁组织TBX2表达的平均光密度和阳性面积率（（±s））Table 1 The average optical density and the rate of positive area of TBX2 in bladder urothelial cancer and cancer side tissue（±s）

*膀胱尿路上皮癌与癌旁组织比较P＜0.05*Comparison between bladder urothelial cancer and cancer side tissue，P＜0.05

组别 例数 平均光密度 阳性面积率Group n average optical density rate of positive area膀胱尿路上皮癌 50 0.3024±0.0085*0.2951±0.0069*Bladder Urothelial Cancer癌旁组织 5 0.0894±0.0031 0.0778±0.0030 cancer side tissue

图1 A：膀胱尿路上皮癌组TBX2的表达。细胞胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒，TBX2阳性表达（→）Fig.1 A The expression of TBX2 in bladder urothelial cancer group.There were plenty of brown particles in the cytoplasm，which showed TBX2 expression

表2 膀胱尿路上皮癌和癌旁组织 PAX9表达的平均光密度和阳性面积率（（±s））Table 2 The average optical density and the rate of positive area of PAX9 in bladder urothelial cancer and cancer side tissue（（±s））

表2 膀胱尿路上皮癌和癌旁组织 PAX9表达的平均光密度和阳性面积率（（±s））Table 2 The average optical density and the rate of positive area of PAX9 in bladder urothelial cancer and cancer side tissue（（±s））

*膀胱尿路上皮癌与癌旁组织比较 *P＜0.05*P＜0.05 Comparison between Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue

组别 例数 平均光密度 阳性面积率Group n average optical density rate of positive area膀胱尿路上皮癌 50 0.2895±0.0073*0.2652±0.0058*Bladder Urothelial Cancer癌旁组织 5 0.0795±0.0029 0.0760±0.0027 cancer side tissue

3 TBX2和PAX9在膀胱尿路上皮癌组织中表达的相关性

经Spearman等级相关分析显示，TBX2和PAX9表达呈正相关（r＝0.462，P＜0.05）。

讨 论

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，目前发病率呈上升趋势，且复发率高，易产生获得性耐药。膀胱癌的病因复杂，既有内在的遗传因素，又有外在的环境因素。较为明确的两大致病危险因素是吸烟和职业接触芳香胺类化学物质［6］。膀胱癌初发时80%为浅表性，其中 70%术后复发，复发者 30%向高级高期发展，15%～30%的患者初发时即具有侵袭性，即使经过治疗，也较早转移［7］。因此，研究与膀胱癌发生发展的分子生物学机理，寻找早期预测膀胱癌发生发展的分子生物学标记物，为膀胱癌的发生和复发的预测提供一定的参考依据具有重要的临床意义。

TBX2基因是发育调控相关转录因子基因，属于转录因子T-box家族成员之一，其通过特有的T-box区域参与多种生物的发育调控，是T-box基因家族成员中仅有的两个转录抑制基因之一。TBX2在各种组织和器官的胚胎发育中起着重要的调控作用。近年来研究发现，TBX2在多种肿瘤中高表达，并且与细胞的凋亡、恶性转化及细胞增殖有着密切关系并参与多种生物的发育调控，属于发育调控相关转录因子基因［8-12］。PAX9基因是PAX基因家族的新成员，PAX9基因广泛参与了脑、胸腺、甲状旁腺等器官的胚胎发育，是胚胎发育中不可或缺的调控基因。目前有关 PAX9基因的研究主要集中在其与牙齿发生、分化的关系方面［13-15］，仅有少量有关PAX9基因在肺癌、食管癌及口腔鳞状细胞癌等方面的研究［16-17］，近年来研究发现，TBX2和 PAX9在多种肿瘤的发生、发展中起重要作用［18-20］。

我们采用免疫组织化学的方法，对膀胱尿路上皮癌组织中 TBX2和 PAX9的表达进行检测，旨在探讨他们与膀胱尿路上皮癌发生发展的关系。结果显示：TBX2和PAX9在膀胱尿路上皮癌中呈高表达，癌旁组织中呈低表达。提示 TBX2和 PAX9与细胞的凋亡及细胞增殖有着密切关系。并且 TBX2和PAX9可作为膀胱尿路上皮癌早期诊断指标。本研究还发现TBX2和 PAX9蛋白表达呈正相关（r＝0.462，P＜0.05），说明TBX2和PAX9在膀胱尿路上皮癌的发生及进展中可能起着协同作用，在肿瘤的发生和发展中的表达影响和作用共同促进肿瘤的生物学行为。

［1］Yakasai A，Allam M，Thompson AJ，et al.Incidence of bladder cancer in a one-stop clinic.Ann Afr Med.2011；10（2）：112-114

［2］Vlahou A.Back to the future in bladder cancer research.Expert Rev Proteomics.2011 Jun；8（3）：295-297

［3］Teng H，Parker M I，Prince S.Functional characterization of cisactingelements involved in basal transcription of the human TBX2 gene：a new insightinto the role of Sp1 in transcriptional regulation.Gene，2008，423（1）：8-13

［4］Nakatomi M，Wang XP，Key D，et al.Genetic interactions between Pax9 and Msx1 regulate lip development and several stages of tooth morphogenesis.Dev Biol.2010 15；340（2）：438-449

［5］Almeida CV，Andrade SC，Saito CP，et al.Transcriptional analysis of the human PAX9 promoter.J Appl Oral Sci.2010；18（5）：482-486

［6］Seront E，Machiels JP.Molecular biology and targeted therapies for urothelial carcinoma.Cancer Treat Rev.2015；41（4）：341-353

［7］Matin SF，Shariat SF，Milowsky MI，et al.Highlights from the first symposium on upper tract urothelial carcinoma.Urol Oncol.2014；32（3）：309-316

［8］Liu W K，Jiang X Y，Zhang Z X.Expression of PSCA，PIWIL1，and TBX2 inendometrial adenocarcinoma.Onkologie，2010，33（5）：241-245

［9］Harris T，Pan Q，Sironi J，et al.Both gene amplification and allelic loss occur at 14q13.3 in lung cancer.Clin Cancer Res，2011，17（4）：690-699

［10］苗雷英，李祥伟，刘超，等.涎腺肿瘤中 PAX9基因的表达及意义.口腔医学研究，2006；22（1）：8-11

［11］Zhu B，Zhang M，Byrum SD，et al.TBX2 blocks myogenesis and promotes proliferation in rhabdomyosarcoma cells.Int J Cancer.2014；135（4）：785-797

［12］Beukers W，Kandimalla R，Masius RG，et al.Stratification based on methylation of TBX2 and TBX3 into three molecular grades predicts progression in patients with pTa-bladder cancer.Mod Pathol.2015；28（4）：515-522

［13］Pinho T，Silva-Fernandes A，Bousbaa H，et al.Mutational analysis of MSX1 and PAX9 genes in Portuguese families with maxillary lateral incisor agenesis.Eur J Orthod.2010；32（5）：582-588

［14］Mu YD，Xu Z，Contreras CI，et al.Mutational analysis of AXIN2，MSX1，and PAX9 in two Mexican oligodontia families.Genet Mol Res.2013；12（4）：4446-4458

［15］Mitsui SN，Yasue A，Masuda K，et al.Novel PAX9 mutations cause non-syndromic tooth agenesis.J Dent Res. 2014；93（3）：245-249

［16］Tallón-Walton V，Manzanares-Céspedes MC，et al.Exclusion of PAX9 and MSX1 mutation in six families affected by tooth agenesis.A genetic study and literature review. Med Oral Patol Oral Cir Bucal.2014；19（3）：e248-254

［17］Lopez SI，Mundstock KS，Paixão-Côrtes VR，et al.MSX1 and PAX9 investigation in monozygotic twins with variable expression of tooth agenesis.Twin Res Hum Genet.2013；16（6）：1112-1116

［18］Mostowska A，Zadurska M，Rakowska A，et al.Novel PAX9 mutation associated with syndromic tooth agenesis.Eur J O-ral Sci.2013；121（5）：403-411

［19］Song T，Wu D，Wang Y，et al.SNPs and interaction analyses of IRF6，MSX1 and PAX9 genes in patients with non-syndromic cleft lip with or without palate.Mol Med Rep. 2013；8（4）：1228-1234

［20］Wang J，Xu Y，Chen J，et al.PAX9 polymorphism and susceptibility to sporadic non-syndromic severe anodontia：a case-control study in southwest China.J Appl Oral Sci. 2013；21（3）：256-264

Expression and clinical significance of TBX2 and PAX9 in bladder urothelial cancer

Shan Guang，Qian Huijun，Xia Yue
（Department of Urology，Renmin hospital of Wuhan university，Wuhan 430060，China）

Objective To investigate the expression and clinical significance of TBX2 and PAX9 in bladder urothelial cancer tissues.Methods Specimens from 50 cases of bladder urothelial cancer and 5 cases of paracancerous tissue were collectedf rom the Department of Pathology in Renmin Hospital of Wuhan University from 2006 to 2009.We examined the expressions of TBX2 and PAX9 in bladder urothelial cancer and paracancerous tissue by using immunohistochemistry.Average optical density and positive area rates of expression of TBX2 and PAX9 were measured by image analysis（HPIAS-1000）.The single factor analysis of variance and SNK test（q）of average optical density and positive area rates were conducted by SPSS13.0 software.Results 1.The expressions of TBX2 and PAX9 were higher in bladder urothelial cancer than in paracancerous tissue，with a significant difference.The Spearman rank correlation analysis showed that there was a positive correlation between expressions of TBX2 and PAX9 in bladder urothelial cancer tissue.Conclusion This result suggests that TBX2 and PAX9 provide a reference value in the diagnosis of bladder urothelial carcinoma.

Bladder Urothelial Cancer；TBX2；PAX9；Immunohistochemistry

R737.14

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.007

2015-06-06

2015-09-10

〔项目来源〕湖北省自然科学基金（青年基金）（2014CFB375）

陕光，男（1980年），汉族，主治医师