小鼠促排卵-体外受精动物模型的建立

冯 清，史鸿志，林 燕，雷承泳

(1、赣州市人民医院生殖医学科，江西赣州341000；2、秦皇岛市妇幼保健院生殖医学科，河北秦皇岛066000)

小鼠促排卵-体外受精动物模型的建立

冯 清1，史鸿志2，林 燕1，雷承泳1

(1、赣州市人民医院生殖医学科，江西赣州341000；2、秦皇岛市妇幼保健院生殖医学科，河北秦皇岛066000)

目的建立小鼠促排卵-体外受精动物模型。方法腹腔注射不同剂量促排卵药物促使昆明小鼠排卵，分析各组剂量下获取的卵-冠-丘复合物和MⅡ卵子数以确定较佳剂量组合。再用微滴法受精+微滴法培养、四孔板法授精+四孔板法培养、四孔板法授精+微滴法培养3种方法实施小鼠体外受精技术。比较各组的受精率、卵裂率、囊胚率确定较佳受精、培养方法。结果⑴6～8周龄昆明小鼠采用尿促性腺激素（HMG）8U+绒促性腺激素(HCG)8U剂量组合获得卵子数目最多，成熟度最好(P＜0.05)；⑵四孔板法授精+四孔板法培养受精率最高，但卵裂率、囊胚率与其它两组无显著性差异。四孔板法授精+微滴法培养既能方便受精操作也有利于胚胎单个追踪观察。结论6～8周龄昆明小鼠采用HMG8U+HCG8U剂量组合能最有效获取卵子；四孔板法授精+微滴法培养是体外受精技术的较佳方法。

促排卵技术；体外受精技术；小鼠卵；模型

小鼠促排卵-体外受精动物模型的建立是临床开展体外辅助生殖相关技术的首要内容。它的建立有利于生殖实验室人员在现有实验环境下熟悉体外受精-胚胎移植操作过程，检测胚胎培养环境，优化体外受精流程，为临床体外辅助生殖相关技术的尽快开展提供实践依据和工作基础。

本实验旨在探索昆明小鼠促排卵药物HMG和HCG的较佳剂量组合和建立小鼠体外受精技术的稳定方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物6～8周SPF级昆明小鼠（动物许可证号：SCXK（赣）2011-0001，江西中医学院实验动物中心）母鼠65只，体重27.58～34.21g，5只一笼饲养；公鼠20只，体重32.25～35.87g，单独饲养。在安静、清洁环境中饲养，自由摄食饮水，12h光照周期。1.2主要仪器体视显微镜（Nikon SMZ800），倒置显微镜（Nikon Ti-S1000），CO2培养箱（Labotect C200），钟表镊，眼科剪等。

1.3 实验试剂HMG（丽珠集团丽珠制药厂），HCG (丽珠集团丽珠制药厂)，G系列序贯培养液（瑞典瑞利芙公司），透明质酸酶（瑞典瑞利芙公司）。

1.4 促排卵药物剂量分组同一批次母鼠随机分成A（HMG6U+HCG6U），B（HMG7U+HCG7U），C（HMG8U+HCG8U），D（HMG9U+HCG9U），E（HMG10U +HCG10U）5组，每组3只。于当天晚上19：30注射腹腔HMG相应单位，48h后腹腔注射HCG相应单位。60~62h后颈椎脱臼法处死母鼠，于输卵管壶腹部捡出卵-冠-丘复合物，用透明质酸酶消化颗粒细胞并计数各组MⅡ卵子数。

1.5 体外受精培养方式分组同一批次母鼠50只，随机分成A（微滴法授精+微滴法培养），B（四孔板法授精+四孔板法培养），C（四孔板法授精+微滴法培养）三组。实验方法参照文献[1-3]方法并改良。

实验步骤：第一天，母鼠晚19：30注射HMG，48h后注射HCG。第三天早上8：00颈椎脱臼法处死公鼠。取公鼠附睾尾及输精管于预热培养液中。在体视镜下用1ml无菌注射针划破附睾尾，并用镊子从输精管中挤出精液。巴斯德吸管吸取精子悬液于另一盛有0.5ml预平衡的洗精受精液（G-IVF）试管中，放入培养箱中获能1h。加精前用计数板计算精子浓度和活力。HCG注射13~14h后处死母鼠，迅速剥离出输卵管并放入预热的取卵胚胎处理液（GMOPs）培养液中。在体视镜下用钟表镊夹住靠近输卵管膨胀部位的漏斗部并使之靠近皿底，另一端用1ml无菌注射针头撕破膨胀部位释放卵-冠-丘复合物。巴斯德吸管吸取卵-冠-丘复合物于另一预平衡的G-IVF培养皿中清洗数次再移入四孔板中（每孔0.5mlG-IVF，盖油，已预平衡）或微滴皿中（每个微滴0.2mlG-IVF，盖油，已预平衡）。加精时间在HCG注射后14~16h，加精浓度调至2~5×106/ml。加精后6~8h拆卵观察双原核及第二极体情况。将正常受精卵挑出移入预平衡的卵裂胚培养液（G-1）四孔板或微滴皿中。第四天早上8：00观察早卵裂情况。第五天早上8：00观察四细胞胚胎情况并制备囊胚培养液（G-2）四孔板或微滴皿。第六天早上8：00观察桑椹胚情况并将胚胎移入G-2四孔板或微滴皿。第七天早上8：00观察囊胚形成情况。第八天早上8：00再次观察囊胚形成情况。

1.6 统计方法受精率=双原核胚胎数/获卵数，卵裂率=胚胎卵裂数/受精胚胎数，囊胚形成率=囊胚数/胚胎卵裂数。采用SPSS 14.0统计软件，各组间均数和标准差（）的比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 促排卵药物剂量分组结果5组促排卵药物剂量分组结果表明：6~8周龄的昆明小鼠随着促排卵药物剂量的增加，卵子数目呈现先增加后减少的趋势。C组剂量组合不仅能获得更多的卵子数目而且成熟卵子数也更多。各组间比较，差异有统计学意义。见表1。

表1 促排卵药物剂量分组小鼠获卵情况（）

表1 促排卵药物剂量分组小鼠获卵情况（）

剂量分组只数体重（g)卵-冠-丘复合物数目MⅡ卵数ABCDE 33333 F值P值28.84±0.66 29.09±0.12 29.32±0.67 29.65±1.33 29.06±0.65 0.46 0.765 11.66±1.53 13.00±2.64 24.00±2.52 16.33±1.53 10.67±3.06 15.98 0.0002 6.67±0.58 6.00±2.00 18.33±2.08 8.33±1.53 6.00±3.61 16.94 0.0002

2.2 体外受精培养方式分组3组受精培养方式结果表明：B组受精率高于A，C组，差异有统计学意义。各组卵裂率，囊胚率差异无统计学意义。见表2。

表2 体外受精培养方式分组小鼠各项指标情况（）

表2 体外受精培养方式分组小鼠各项指标情况（）

剂量分组只数体重（g)受精率（%）ABC 8 22 20 F值P值29.85±1.47 29.84±2.15 30.49±2.33 0.549 0.5813 60.38±6.98 71.95±19.56 61.38±9.61 3.81 0.0425卵裂率（%）囊胚率（%）97.73±4.55 98.26±2.96 99.85±0.56 2.64 0.0819 86.39±3.06 84.96±12.83 86.57±3.15 0.191 0.827

3 讨论

人类辅助生殖技术是借鉴小鼠促排卵体外受精模型而建立起来的[4]。小鼠促排卵技术是小鼠体外受精技术实施的基础。小鼠促排卵药物一般是孕马血清促性腺激素PMSG和人绒毛膜促性腺激素HCG。每只小鼠注射剂量从5~10U不等[5-7]。促排卵效果不仅与小鼠品系、周龄、体重有关，还与促排卵药物的种类、剂量、厂家、批次、注射间隔时间等有关[8-11]。本实验购买同一批次SPF级性成熟昆明小鼠适应本舍光照周期和饮食条件一周后再分组实验。因此小鼠品系、周龄、体重对促排卵技术的影响不大。本实验将作用相似的HMG代替PMSG，更能模拟人类辅助生殖技术的促排卵用药模式。剂量分组结果显示小鼠的排卵数量和质量随促排卵药物剂量的增加呈现先增加后减少的趋势。这种趋势在人类促排卵技术中也存在。杜秀雅等[12]认为促排卵引起多个卵泡发育，卵泡周围氧浓度降。卵泡长期缺氧可能影响卵泡液中的生长因子从而影响卵子的发育和质量。据此推测：昆明小鼠促排卵药物剂量有某个阈值能最大限度地刺激卵子生长同时卵泡周围的氧浓度总量限定了这些卵子的数目。C组剂量正好在这一阈值内，故本实验的后期实验采用了该组剂量。

微滴法受精培养指单个卵子或胚胎单独受精或培养。该法操作繁琐但便于单个卵子或胚胎的观察，具有连续性和独立性[13]。四孔板受精培养指将多个卵子或胚胎一起受精或培养，培养液的量较微滴法多。该法操作方便简单且被证实有利于囊胚的培养[14]。本实验结果显示微滴法比四孔板法受精率更低，差异有统计学意义。原因可能为微滴法操作时间更长，卵子暴露于外界的时间更长。卵子周围温度和渗透压的改变更剧烈，卵子的成熟和发育受到损伤。3组的卵裂率、囊胚率差异不显著。原因可能为受精后胚胎在不断发育生长，各种细胞器和细胞膜功能在增强。胚胎抵御外界因素改变的能力较卵子强。卵裂能力和囊胚形成能力由胚胎的发育潜质决定。在熟练操作下，培养方式并不能改变胚胎的发育潜质。王利红等[15]认为胚胎发育潜质差异在胚胎接种时就存在。本实验的培养方式分组结果提示本科室在开展人类体外受精技术时可采用四孔板法受精，微滴法培养胚胎相结合的方法。这既有利于保护卵子的发育潜能又有利于单个胚胎的追踪观察和筛选优质胚胎。

总之，通过小鼠促排卵体外受精技术模型的构建，实验室人员摸索了适合本中心的体外受精培养方式，熟练了体外受精操作流程，为临床辅助生殖技术的顺利开展奠定扎实的工作基础。

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Establishment of the controlled ovarian hyperstimulation(COH)-in vitro fertilization(IVF)murine animalmodel

FENG Qing，SHI Hongzhi，LIN Yan，et al.
People’s Hosiptal of Ganzhou，Ganzhou Jiangxi 341000，China.

Objective To establish a controlled ovarian hyperstimulation(COH)-in vitro fertilization(IVF)model in mice. MethodsIntraperitoneal injection of different dosage of hormone（HMG6U+HCG6U，HMG7U+HCG7U，HMG8U+HCG8U，HMG9U+HCG9U and HMG10U+HCG10U）were carried out to stimulate Kunming mice ovulation，then the quantity of oocytecorona-cumulus complexes and MⅡoocytes in different groups were analyzed to get the preferred dose combinations.Furthermore，Three methods including micro-drops fertilization and micro-drops cultivation，4-well dishes fertilization and micro-drops dishes cultivation，4-well dishes fertilization and 4-well dishes cultivation were used in vitro fertilization technique.The fertility rate，cleavage rate and blastocyst rate were compared in different groups to choose better fertilization and cultivation method.Results⑴The biggest amount and the best quality of oocytes were found in Kunming mice of 6-8 weeks of age injected with HMG8U and HCG8U(P＜0.05)；⑵The fertility rate of 4-well dishes fertilization and 4-well dishes cultivation was significantly higher than the other two groups.However，the cleavage rate，blastocyst rate had no significant difference between the other two groups.4-well dishes fertilization and micro-drops dishes cultivation were convenient and available to observe embryo fertilized single trail as well.Conclusions HMG8U and HCG 8U were found out to be the most effective acquisition of oocytes in Kunming mice aged 6-8 weeks.4-well dishes fertilization and micro-drops dishes cultivation was the preferred method of in vitro fertilization techniques.

Controlled ovarian hyperstimulation；In vitro fertilization；Mouse oocyte；Model

R-332

A

1674-1129(2015)06-0714-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2015.06.007

2015-09-28；

2015-10-27)

赣州市指导性科技计划项目（编号：20120410）

冯清，女，出生于1984年5月，硕士，主管技师，研究方向：生殖医学与遗传医学。